DNA倍体分析5.19【91360病理技术沙龙案例28】

病理小咖

靳耀锋-西安交大第二医院
前两年国内一家公司推广过该类检查，好像是武汉的，理论上讲E6/E7mRNA 检测对恶性病变诊断具客观的参考价值（高危型、转化活性的HPV产的癌蛋白-P53失活的元凶之一），也不知什么原因没推广起来，可能是没写进共识吧，也可能编码RNA不像EBER那样稳定（特别是石蜡组织），HPV分型、DNA倍体分析、P16/Ki67、E6/E7mRNA ，看把个宫颈病变、HPV折腾的，不过我觉得还是细胞学客观特别是DNA倍体分析，对诊断、筛查早期宫颈癌很有用。

闫秀川
DNA倍体分析很多人还不认

闫秀川
我们都还在犹豫，你们上了吗？

靳耀锋-西安交大第二医院
做了2年多了，总结了一下，临床反应不错，现在已自动化了，自动换片子扫描，有疑问的人再看看，检出3个超2倍体细胞，做活检基本都是CIN3以上病变，我不是做广告，我们妇科大夫都说比较准。

闫秀川
用的哪家设备？兰丁的吗？

靳耀锋-西安交大第二医院
RNAscope 是单拷贝灵敏度的RNA 检测技术（放大数千倍），实验室用没问题，临床用于检测最少单个的RNA分子，意义有多大呢？有时间学习一下。

靳耀锋-西安交大第二医院
@闫秀川  麦克奥迪

靳耀锋-西安交大第二医院
麦克奥迪用的是加拿大技术

靳耀锋-西安交大第二医院
他们用的是我们组织化学Feujgen染色，盐酸水解掉一个碱基就结合一份子Schiff、硫堇类染料，DNA的量与结合染料的有线性关系；我们做一个染色40元，人家一例270元，不过分析软件也很值钱。

李杨
@靳耀锋-西安交大第二医院 单拷贝的意义在于可以进行定量分析，也就是说可以像DNA FISH那样计数RNA的拷贝数，对应临床样本治疗或预后信息，可以计算出cutoff值

靳耀锋-西安交大第二医院
RNA拷贝数变化远在DNA之上，本身RNA容易水解，石蜡定性还可参考，定量就难多了，即使用荧光，也很难看到独立的点存在，定性的意义更大，临床的使用还得积累数据，同时我们常规组织处理的重要性更紧迫，RNA对碱敏感，处理过程需要注意。

黄小七
靳老师。目前测病毒核酸拷贝数对病理或临床的意义是？

靳耀锋-西安交大第二医院
@黄小七  都是参考大数据及临床资料得出的结论，来间接判断病情和预后、指导用药，动态监测更有意义，有时病原学、生化等数值与临床过程不是完全一致的。

黄小七
嗯嗯。可能是我观念比较落后把。觉得病毒的生活史中某种核酸拷贝的增加与蛋白合成量的扩大看得太细还不如一刀切了实在特别是在hpv这个情况下。和临床谈e七e六的定量不知道对他们帮助有多大。我觉得他们还是倾向实实在在的高级别和低级别。请叫我老古板

李杨
RNAscope技术的特点就是操作流程和免疫组化类似，从国内很多医院的检测结果来看，保存5年以内的石蜡样本是可以检测的

李杨
当然RNA检测和免疫组化一样，最怕的是delayed fixation

黄小七
@李杨 谢谢资料

李杨
@黄小七 谢谢您！对于病毒检测，目前比较流行的原位杂交检测是HIV，CMV，EBV，HCV，SARS，寨卡等

黄小七
嗯嗯。今天我下班晚了。希望这节课能有机会再听一次。

靳耀锋-西安交大第二医院
方法学进步与临床受益是有矛盾的，标准ARMS方法检测全阴的T790M，用ddPCR 、ACB-ARMS方法检测就有22%检出了阳性，原因是方法学敏感性提高了100倍；现在很多试剂盒已用“检测极限”代替直接“阴性”，表明了检测方法敏感性的不断跃进与病人受益之间的矛盾，比如免疫组化敏感到检测单个蛋白分子，估计所有指标都呈阳性了，可能陷入不可知论。这时候量化和阈值就非常重要，检测的阈值（方法极限性等-正常组织或非靶组织总会有阳性），检测结果的丰度、分层，动态分析会真正促进个体化治疗。如现在EGFR突变检测只是在1%的敏感性内报突变或野生，慢慢会随着定量PCR如 ddPCR ，就要报告突变的比例、等位基因突变模式等；所以量化是以后的方向，病理标本处理的规范化是免疫组化、分子等量化的基本保证。

李杨
我们以后会再要求美国的专家介绍RNA检测在免疫治疗、肿瘤靶点开发、感染性疾病、药物安全评价、NGS整体化解决方案等应用领域的介绍

北京和睦家一样 庄然
@靳耀锋-西安交大第二医院 不简单的解释阴阳了

黄小七
知识的转化方面。美帝确实牛

李杨
@靳耀锋-西安交大第二医院 其实RNAscope最大的特点在于是个组织细胞学水平的新技术，尤其对于肿瘤存在异质性表达或进行肿瘤微环境分析时，定量的拷贝结果能更准确的反映同一个biomarker在不同细胞中的表达情况

靳耀锋-西安交大第二医院
信噪比的确高，达到八九千比一，史无前例，我下来做实验时用

李杨
除此之外，RNA分子具有DNA和蛋白两个分子水平的特性，比如在ALK基因检测中，ALK RNA融合探针既能反映ALK与已知基因发生的融合情况，又可以根据RNA表达的扩增判断量的变化，结合组织形态学的定位信息，更好的为诊断提供依据

靳耀锋-西安交大第二医院
理论上可以，DNA探针几十到几百KB，断裂点分离探针判断还有10%以上的cut-off；RNA融合的定量、性检测也需要较长的探针保证特异性和杂交稳定性，RNAscope 的探针很特殊（好像是Z型），在石蜡中检测结果要用于临床估计还得再积累积累数据。

靳耀锋-西安交大第二医院
中杉公司也在快讯上推广RNAscope 技术，据说可在Rhoch机子上自动染色，有时间了解一下

李杨
RNAscope其实是用针对同一个RNA分子的不相邻的20个特异性位点设计的“ZZ”型的mix型探针，所以即使在石蜡样本中RNA分子出现了部分降解，仍然不影响对RNA分子的检测灵敏度，目前已经有不少临床研究类的文章发表了，比如PD-L1，HER2，c-Met，ALK，Kappa/lambda，FGFR1，PTEN等

李杨
目前可以在罗氏和Leica的全自动机器上染色，不过还是科研型的机器

靳耀锋-西安交大第二医院
@李杨  加强合作，RNA的质量特别是5'端，组织固定、石蜡保存是很重要的，方法高度的敏感性，特别是检测不完整分子（与FISH有别），其特异性及量化拷贝数会受影响。

李杨
@靳耀锋-西安交大第二医院 谢谢您！我的专业就是分子病理学，RNA还是个比较新的概念，期待能找到更多的应用，尤其是抗体效果不是很理想的检测项目。未来还会有点突变检测探针、融合基因检测探针、DNAscope探针以及双染和多重染色探针发布出来

李杨
目前也有很多人做非编码RNA研究，可以用这个技术

靳耀锋-西安交大第二医院
非编码RNA比较稳定，在石蜡应该比mRNA效果好，但可能拷贝数少一些，如EBER。

靳耀锋-西安交大第二医院
测序、杂交、CTC等都逐渐走向单细胞、单拷贝，原位检测的系列方法更是我们病理及病理技术的主战场，组织处理的规范化也要逐渐走向量化、评价监测指标客观化（如蛋白磷酸化、核酸甲基化、糖类的单元重复次数等），以保证我们保留的组织在以后回顾性研究中不是粗制品和垃圾（全球现在大约有15亿个蜡块），说起容易做起难，现有个深刻认识，就有可能前进了…

安庆市立 小慈
RNA酶无处不在，组织处理是不是就要有一些特殊的处理，对于常规的病理技术会不会有影响呢？还是说以后的每个病理组织直接多种处理方法并用呢？

侯春晓-海宁人医
最近妇科体检出来很多CIN1-3 同时HPV数值又比较高，我是希望E6/7检测能够稳定开展！

靳耀锋-西安交大第二医院
慢慢探索，先做好目前的组织处理

安庆市立 小慈
DNA RNA还有蛋白的表达不一定是有相关性，即使有是正相关还是负相关也有区别，那么临床病人的用药究竟该以哪一个为金标准呢？

靳耀锋-西安交大第二医院
@安庆市立 小慈  对靶向治疗和检测而言，目前临床以NCCN、中国各类指南为准，我们做检测参考ASCO及中国检测指南或共识，他们有循证医学和临床试验的的数据支持。

李杨
@安庆市立 小慈 RNAscope技术由于灵敏度的提高，不需要特殊的组织处理，石蜡切片的处理条件就是10% NBF就可以，和做免疫组化是一样的

李杨
@安庆市立 小慈 RNA和蛋白在表达上不一定有相关性，所以RNA的检测并不是免疫组化方法的替代，在抗体染色效果不理想的项目上可以用mRNA的检测替代，比如前面提到的HPV E6/E7，还有诸如PTEN，Albumin，FGFR等。也可以作为抗体染色的确证，比如PD-L1，HER2，cmet等

李杨
在未来临床用药的检测中，任何一种方法都有自身的优势，所以更重要的是哪个方法和临床人群的结果更加匹配，所以伴随诊断药物在选择检测技术时往往都是多个技术平台同时检测入组病例，比如PCR，FISH，免疫组化等，RNA技术只是在转录组水平检测的一个新的选择

本案例根据中华病理学技术网讨论记录整理 ，内容仅代表个人看法，旨在共同分析、学习病例诊断思路，意见仅供参考。需要加群讨论的请加微信号：Miss_Puffbaby或病理程晓军（pathology_cxj）。