《Nature Medicine》连发两篇重磅研究，肿瘤液体活检版图或将面临重构！

就爱小小酥

　　液体活检（liquid biopsy）曾被《麻省理工大学科技评论》评选为“2015年十大突破技术”，并被 《科学美国人》评为“2017十大新兴技术”之首。在过去的五年里，液体活检以其独特的优势成为肿瘤临床与研究、创业者、投资者趋之若鹜的热点领域。

　　当前，肿瘤液体活检主要的检测标志物包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和外泌体等。其中，ctDNA因为获取容易、进入门槛较低，在近年来成为炙手可热的投资领域，不时出现大额融资消息，尤被业界寄予厚望；相比之下，CTC因为获取困难、门槛相对更高，颇有波澜不惊的一身“佛性”。但是，《自然·医学》（Nature Medicine）近期接连发布的两篇重磅研究，或将预示液体活检版图的重构。

　　11月25日，《自然·医学》在线发表了题为《超深度测序揭示血浆cfDNA突变来源》（High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants）的重磅文章，其结果让研究者惊讶得“差点掉下椅子”。

　　cfDNA全称是循环无细胞DNA（circulating free DNA），是指游离于血液中的细胞外DNA，主要来源于衰老、凋亡的血细胞（如造血细胞）释放的片段化DNA。

　　ctDNA是全称是循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA），ctDNA在cfDNA中的占比很小，仅为0.1%-5%。因此，ctDNA检测最大的挑战来自于正常血细胞来源的DNA干扰，如克隆性造血相关突变。

　　来自美国纪念斯隆·凯瑟琳癌症中心（MSKCC）病理学主任Jorge Reis-Filho和临床医学科学家PadramRazavi共同主导了这项研究，他们使用超深度测序（深度60,000×）验证124名晚期癌症（乳腺癌、肺癌、前列腺癌）患者的cfDNA突变的真正来源，并明确临床测序方法测得ctDNA突变的真实性。

　　此项临床研究设计异常缜密，共使用了两种测序方法，一种是FDA批准的临床测序方法，另一种是超深度测序。并对比使用两种测序方法时，ctDNA与配对白细胞、ctDNA与配对组织的突变谱一致性。对照组为47名未罹患肿瘤的健康人。考虑到肿瘤治疗会引起克隆性造血相关突变增加，入组的124名患者在cfDNA获取时前后6周均未进行任何治疗。研究者还充分验证了超深度测序的高度准确性。


严谨科学的试验设计：先明确ctDNA肿瘤突变，再利用深度测序明确ctDNA真实性
#超深度测序：靶向目标区域2M，深度60,000×，该方法具有极高的准确性和重复性，且使用数字液体PCR进行了充分验证。每碱基错误率仅为1×10-5至3×10-5，假阳性率为每一百万碱基测序错误<1次。

　　令人惊讶的结果一：cfDNA突变与组织突变的真实一致性不到1/4

　　使用超深度测序后，cfDNA与配对组织的一致性仅有24.4%，而临床测序法得到的一致性为72%。

　　令人惊讶的结果二：超过50%的ctDNA突变其实是“假阳性”，即来源于白细胞而非肿瘤

　　通过超深度测序发现，晚期癌症患者即使通过FDA批准的临床测序方法得到的ctDNA突变结果，53.2%竟不是肿瘤突变，而是白细胞突变！

　　导致ctDNA突变超过50%假阳性的原因是克隆性造血相关突变增多。肿瘤治疗（如放疗、化疗）很容易诱导出现克隆性造血相关突变。



X轴：每个cfDNA样本     Y轴：cfDNA每兆（Mb）的突变变异

　　因此，来自美国纪念斯隆·凯瑟琳癌症中心的临床医学科学家和病理学家非常担忧：现行的ctDNA临床测序方法（即使是FDA批准）可能无法有效清除大量克隆性造血突变的背景干扰，因此ctDNA的基因突变谱、包括TMB在内分子标签的准确性就大打折扣。因为如果不同时对白细胞进行60,000X以上超深度测序（临床使用的cfDNA测序方法一般在10,000×），ctDNA突变检测假阳性会≥50%，如果患者接受放化疗，假阳性会更高。

　　写到这里，小编也不禁为众多基于ctDNA的巨额投资项目捏把冷汗。号称用cfDNA/ctDNA能完美解决肿瘤早筛的观点现在看来还有不少的问题需要去面对。

　　无独有偶，英国肺癌研究联盟（TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy [Rx]）10月也在《自然·医学》发表了重磅的研究成果，TRACERx研究呈现了基于CTC的高通量测序（CTC-NGS）能够实时追踪肺癌进化轨迹，提前数月获取转移灶的基因信息，展现了精准预防转移发生的巨大临床应用前景。



　　研究共纳入了100位早期非小细胞肺癌患者。研究发现，早期肺癌患者手术时的肺静脉CTC（PV-CTC）能有效预测手术后的生存和复发情况。更值得关注的是，研究者运用高通量测序技术对肿瘤组织（原发灶多个部位、转移灶）和液体活检标本（CTC和cfDNA）进行基因分析，并分别对比了ctDNA、CTC与原发肿瘤、转移病灶间的信息一致性，旨在揭示肿瘤演化轨迹，探寻转移发生的分子机制，为临床如何干预能有效降低肺癌复发率，预防转移提供研究基础。

　　令人惊喜的结果一：肺癌早期的CTC比cfDNA携带更全面的肿瘤基因信息



　　肺癌早期CTC和ctDNA能否携带全面的肿瘤实时生物学信息，直接影响其在液体活检领域的发展前景。本研究充分证实了CTC在全面反映肿瘤生物学信息中的独特优势。

　　令人惊喜的结果二：肺癌早期CTC与10个月后转移灶基因突变一致性达到91%


　　肺癌早期PV-CTC91%的突变可在10个月后发生的转移灶组织中检出（181/198），而在原发灶该比例只有79%（157/198）。

　　令人惊喜的结果三：肺癌早期CTC与转移灶属于同一肿瘤进化分支，是肺癌复发的直接原因

　　研究者通过系统的肿瘤进化生物学分析发现，肺癌早期CTC和转移灶属于同一特异的肿瘤进化分支，该分支与原发肿瘤截然不同。因此肺癌早期的CTC正是导致术后复发的直接原因。



　　肿瘤早期CTC不仅能携带原发肿瘤的突变信息，也能携带数月后发生的转移灶突变信息，这提示了CTC在克服肿瘤时空异质性，提供肿瘤实时、全景基因突变谱的独特优势，CTC甚至为提前预知转移机制、明确遏制转移的治疗靶点、降低肺癌术后复发率方面，展现了巨大的应用潜能。

　　最后，小编脑海里不禁浮现出那句老话：上帝关上一道门，就会打开一扇窗。在cfDNA带大家兜了一大圈又一圈之后，CTC不失时机地褪去“佛性”，开始出场了。至于CTC的热度能有多猛？液体活检的“下半场”，还让我们拭目以待！

　　参考资料：
　　[1] Razavi, P., Li, B.T., Brown, D.N, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants[J]. Nature medicine, 2019. doi:10.1038/s41591-019-0652-7
　　[2] Chemi, F., Rothwell, D.G., McGranahan, N. et al. Pulmonary venous circulating tumor cell dissemination before tumor resection and disease relapse. Nat Med 25, 1534–1539 (2019) doi:10.1038/s41591-019-0593-1