基于微珠的多重PCR和多重ELISA-泰瑞镜下显微荧光平台简介

泰瑞镜下

泰立瑞病理

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关键词：多重PCR、实时PCR（Real time PCR）、多重ELISA、细胞因子、自身抗体、抗核抗体（ANA）、自体免疫疾病诊断、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎（RA）、系统性硬化症、核酸杂交、免疫荧光；微珠；显微镜成像技术、自动荧光显微镜定制化

泰立瑞的泰瑞镜下（TR-sWSI）是一个高度通用的显微镜平台，之前泰立瑞仅仅用于载体为切片的病理全切片明场、荧光扫描、分析，现在泰立瑞将其延伸到同样适用于溶液的、基于微珠技术的图像采集、分析（例如多重聚合酶链式反应mPCR、多重ELISA）和细胞模式识别。其在动态、加热条件下跟踪变化的多重、实时能力使其成为实时PCR（real time PCR）和监测核酸杂交动力学的有用工具，这些实时动力学数据是那些使用终点检测技术无法获取的。本文将介绍泰瑞镜下平台的技术原理，介绍基于微珠技术检测各种生物分子（包括抗原、抗体、肽、寡核苷酸和DNA扩增产物）的的解决方案，TR-sWSI的广泛适应性和多功能性使其极具有竞争优势。医学、生命科学的许多惊人成就都基于创新分析技术的进展。大多数这些技术平台都具有高度的技术复杂性，但仅适用于一种应用。其中大多数只能够同一样本中检测一个目标，不能进行多重检测（multiplex assay）（多重水平从小于10个到较高数目大于1000）。而且许多技术，如平面微阵列，无法理想地测量动力学数据，而只提供终点测量。而且常常一个项目中，可能需要进行从酶分析、核酸扩增和杂交到抗原/抗体检测的测量。为所有这些不同的任务提供的检测设备累计起来可能相当昂贵，并且需要实验室空间很大。南京泰立瑞的显微扫描的TR-sWSI-FLUO技术，为用户提供了广泛的应用，检测对象包括细胞、核酸和蛋白质，覆盖组织切片、多重ELISA、多重PCR(需要整合的加热/冷却装置即热循环仪)等常用分析技术。TR-sWSI-FLUO由泰立瑞开发的软件TR-sWSI-Fluo和硬件组件组成（3-5个荧光通道的倒置荧光显微镜、运动扫描台、至少有130万像素的数码相机以及可选的加热/冷却装置（HCU））。TR-sWSI-Fluo软件采取模块化设计，可以为不同的测量任务由不同分析模块完成，例如微珠测量、荧光读数和计数的模块。扫描运动平台支持任何透明平面底部的样品载体，例如96-384孔板的多重ELISA、多重PCR，细菌检测和计数和显微镜载玻片等。

图一-A

TR-sWSI-Fluo可以将HCU整合进来。该HCU装置使用珀耳帖元件（Peltier elements），可以定制化到扫描运动平台中（图一-A），其加热和冷却速率分别高达10度/s，温度范围在15~105°C之间，温度分辨率小于0.1℃。

图一

图一. 泰立瑞.TR-sWSI-FLUO平台，包括硬件部件和加热/冷却装置的示意图, 左图显示包括照明光源、CCD或CMOS相机、滤镜和物镜的光学系统，设计取倒置显微镜模式，对96孔PCR板或96孔ELISA板进行图像采集。右图显示整合了温控系统的示意图。TR-sWSI-FLUO技术能在不同时间点多次测量同一个微珠以获得实时反应动力学。流式细胞仪技术常用于测量多重微珠（多种血球、多种荧光标记的细胞亚群的分析），但使用流式细胞仪不能在不同时间点多次测量同一个微珠以获得实时反应动力学。泰立瑞的TR-sWSI-FLUO技术克服这些缺点，开发了基于微珠的核酸和蛋白质图像自动采集和分析技术。更具体的，该技术基于一组组具备特定大小尺寸和以两种不同染料以特定混合比例（产生不同的颜色）的微球，同样大小但不同颜色的被认为是不同的微球，同理，不同大小但相同颜色的也被认为是不同的微球，也被赋予不同的编码。微球的识别基于其大小和颜色（显微图像采集和算法），每组微球被给予一个不同的编码，N种大小和M颜色可以编码N*M种微球。这是一种非常简单但非常有效的编码策略，一个编码的微球仅被赋予一种被分析物，允许在多重分析中通过编码（大小和颜色）识别单个微球从而在同一溶液种进行多重检测。

图二

图二, 18个微珠群体的编码。微珠群体由两种不同的荧光染料以不同比例组合编码，并作为灰度值处理。微球位于微孔板孔的透明底部便于对焦。微珠不需要固定。在每个加样孔中，可同时测量多个微珠群（多参数）。微珠成像通常使用10 9/0.30物镜进行，该物镜能够对直径为6–30 微米的微珠进行成像，在相机传感器上创建直径为9个像素的图像（像素大小6.5 *6.5 微米），这对于图像处理来说是足够的分辨率。由于景深仅为2.7 微米，因此必须有自动算法进行自动对焦。理论上，每个图像覆盖670 *900 微米的区域，包含多达500个单个微珠。荧光激发的强度不是恒定的，TR-sWSI-Fluo只使用不同荧光通道之间的比率，而不是绝对值。荧光染料的比例对于每个微珠群体都是特定的。此外还有直径大小也用作分类参数。每个微珠群的表面用特定抗原/抗体/核酸修饰，用来检测样品中的不同分析物，此时使用与构成微珠的两种荧光染料不同的第三种荧光染料染色。待检测物的结合导致微珠周围出现荧光光晕（图三）。强度由图像处理算法确定。

图三-A

图三-A. 单个微珠和其荧光标记的分析物（红色光晕）。分析物的强度在微珠的边缘进行测量或量化。微珠的身份鉴定通过其大小尺寸（直径）和荧光颜色ID得到：

图三-B

图三-B. 七种微珠log10群体混合后的图像，密度约为700 /mm2微球数，红色外圆=阳性。直径和荧光颜色ID确保每个微珠分配给一个特定群体，且具有唯一性，使用这种方法的错误分类概率远低于1%。如果两种染料按1:10到10:1的比例对每个微珠进行编码，则可以计算-1到+1的荧光颜色ID。TR-sWSI-FLUO应用于多重抗体（或抗原）检测：

图四

图四. 抗体（或抗原）微珠检测方案。将携带不同抗原的三个微珠群1、2、3固定在微孔板上。抗体（例如特异性自身，图中标记一抗）仅与相应的抗原（微珠3表面的抗原）结合。一抗由荧光团标记的二抗体识别，在微珠3表面产生不同于微球本身颜色（二种荧光的混合）的第三种荧光。TR-sWSI-FLUO应用于多重PCR：

图五-A

图五-A. 基于微珠杂交探针的多重PCR。3‘’端荧光标记的单链捕获（通过核酸杂交）探针通过其5‘端’生物素与微珠表面的链霉亲和素结合。“显色探针”在其5°端标记有有淬火剂Q（Quencher）。在没有PCR产物杂交的情况下，保留捕获探针和检测探针在溶液中，不会发生荧光能量共振转移（FRET）荧光。

图五-B

图五-B. 基于微珠杂交探针的多重PCR。3‘’端荧光标记的单链捕获（通过核酸杂交）探针通过其5‘端’生物素与微珠表面的链霉亲和素结合。“显色探针”在其5°端标记有有淬火剂Q（Quencher）。当PCR扩增产物随着PCR反应进程其数量增加时，“显色探针”和捕获探针与PCR扩增产物杂交，捕获探针3‘端’的荧光标记和显色探针5‘端的Q被安置在一起’而产生的FRET荧光（不同于微球和单链捕获探针3‘端’的荧光）

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图六. 泰立瑞全切片扫描仪（TR-sWSI-5F）目前应用于病理切片的明场和荧光扫描，其本质是一台自动显微镜，因为其模块化设计，可以被方便地定制化为基于显微技术的高端多重PCR仪和高端多重ELISA仪。南京泰立瑞信息科技有限公司是一家创新型的科技公司，拥有自主研发及独立生产能力。致力于显微图像的采集和分析，公司产品包括数字病理产品线包括低成本全自动数字病理扫描仪，手动数字病理扫描仪和远程病理会诊系统，及以替代人工镜检的相关检验、病理人工智能产品，公司也输出技术研发能力，从事自动显微镜相关的OEM服务。已获2个2类医疗器械注册证。研发团队在计算机人工智能和大数据领域有丰富研究和工程经验，擅长软硬件整合。