多重免疫荧光/多重免疫组化及肿瘤微环境系列1

泰瑞镜下

泰立瑞病理

往期回顾：

购买全自动免疫组化染色机要考虑的因素 https://m.sohu.com/a/502810209_100274186?_trans_=010004_pcwzy

泰立瑞全自动免疫组化染色仪：兼容载玻片和盖玻片染色的全自动免疫组化染色仪 https://m.sohu.com/a/494764116_100274186?_trans_=010004_pcwzy

哪些生物和临床病理应用需要盖玻片染色？ https://m.sohu.com/a/495251373_100274186?_trans_=010004_pcwzy

组织多重免疫染色技术的方法学概述关键词：肿瘤微环境、免疫治疗、多重免疫组化、多重免疫荧光、DSP、组织质谱分析、PD-1、PD-L1、免疫细胞、流式细胞仪、癌症预后、全自动免疫组化染色机蛋白质水平的多重免疫组织化学（mIHC）和多重免疫荧光（mIF）能分析、量化肿瘤中免疫细胞亚群、其功能状态及其在肿瘤微环境中的空间排列等，是目前检测肿瘤微环境免疫状态的核心技术。在准备开展mIHC/mIHC时样本数量、多通道成像、预算和是否有图像分析能力是重点考虑的事情。由于所有多重免疫组化（mIHC/mIF）都有创建和验证多种抗体组合的过程，我们南京泰立瑞的建议基本上都是关于创建一个由10-60个抗体组成的多重免疫组化检测模块的。我们提供了一个基于多重mIHC/mIF的初级介绍，整理了关键资料，并概述了计划和执行此类实验的主要考虑因素，主要受众是基础或转化医疗研发人员，或准备开展mIHC/mIF常规检测前建立方法学的临床病理、检验人员。本篇是mIHC/mIF系列的第一篇，给感兴趣者一个整个领域的概况。领域简介肿瘤微环境（TME）中宿主和肿瘤细胞有着复杂交互，包括多种免疫细胞（T和B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和不同的髓样细胞巨噬细胞和粒细胞等类型），具有特异性免疫活性的蛋白质表达，免疫程序性细胞死亡检查点蛋白质-1（PD-1）/程序性细胞死亡配体1（PD-L1）、细胞因子（如干扰素γ）和基质细胞、血管和成纤维细胞等，它们都有独特生物学意义。其中一些，如PD-L1在肿瘤和/或免疫细胞的表达，及治疗前肿瘤标本中的CD8+数量、T细胞浸润的密度等与肿瘤对免疫反应相关检查点抑制剂（PD-1/PD-L1抑制剂）的临床治疗反应高度相关。此外，研究肿瘤对免疫治疗的反应有助于理解免疫治疗是如何重塑肿瘤免疫微环境，理解这些治疗的作用机制和发现提示早期治疗效果的生物标志物。基于这些早期对TME成功研究，引起了人们试图扩展对TME描述的维度和指标，旨在识别新的可用于物精确医学的生物标志物。目前具有最大临床应用价值的生物标记物来源于与肿瘤直接相关的细胞群。外周血免疫细胞与TME中的细胞组成相关性较差，因此，迄今为止，外周血研究对实体瘤免疫治疗的价值有限。实体瘤标本的研究也也面临实体瘤组织可用性有限、在石蜡包埋前肿瘤样本处理的一致性差、标记物表达的空间异质性以及围绕原位检测复杂或罕见细胞表型的挑战。流式细胞术是一种强大的细胞表型分析方法，但要求新鲜组织、低细胞产量和空间信息的丢失限制了此类方法的常规应用，目前主要应用于外周血的细胞表型分析。美国TCGA项目中使用的DNA和RNA组学方法为探索肿瘤分类以及免疫浸润的预后意义提供了大量数据集。但这些分析的输入异质性很强，因为样本包括所有TME细胞以及一定比例的非肿瘤组织。尽管生物信息学计算方法已被用于反褶积mRNA表达数据，因此单个细胞类型可以进行虚拟表达谱分析，但单细胞的空间分布信息都丢失殆尽。类似地，单细胞RNA-seq允许对单个细胞的表达谱进行表征分析，但也丢失了空间信息。相比之下，免疫组织化学（IHC）可以区分TME内表达相同蛋白质的不同细胞类型，并且可以描述其密度和空间分布。IHC还可以提供标记强度的定量评估。免疫荧光（IF）较IHC的一个显著优势是，即能够检测更大蛋白质动态表达范围。最近的多项研究证实，与DNA NGS测序、RNA表达谱GEP及单一PD-1 IHC检测相比，基于mIF/mIHC多种指标的肿瘤微环境（TME）综合指数是最好的生物标志物, 在预测抗PD-（L）1治疗的客观反应方面比其他方法具有更高的性能。这些发现强调了共表达和空间分布指标的潜在生物标志物价值。总之，免疫系统与肿瘤细胞之间的相互作用是癌症预后和治疗的重要特征。蛋白质水平的多重免疫组织化学（mIHC）和多重免疫荧光（mIF）分析是用于量化免疫细胞亚群、其功能状态及其在肿瘤微环境中的空间排列的技术，是目前检测肿瘤微环境免疫状态的核心技术。行业普遍认为，我们需要mIHC测试肿瘤微环境来理解患者的免疫原性，就像需要NGS来理解突变类型和突变负荷，需要液体活检方法持续监测治疗后的反应，未来对肿瘤患者进行mIHC和NGS联合检测应该成为标配。多重技术可高精度和准确度展示组织中单个细胞表达的2-50个标记。mIHC可以通过一次向一张切片上添加多个抗体及标记（例如VentanaRoche或Biocare Medical）或使用一次一个抗体的染色、剥离、照相循环方法来进行。mIF技术有多个平台，包括可支持4-5重的标准IF分析技术及可支持6-8重分析的多光谱技术（Vectra 3.0TM/Polaris）。更高的多重染色方法包括多离子束成像（multiplex ion beam imaging）、飞行时间成像（MIBI-TOF）、成像质量流式细胞术（imaging mass cytometry-IMC)和数字空间分析（digital spatial profiling-DSP）等。我们简要总结了这些不同方法的基本原则，以及每种方法的优缺点（表1、图1中）。实践中，每种方法都需要优化和验证。表一：不同的组织多重免疫技术的比较

Taube JM, Akturk G, Angelo M on behalf of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) Pathology Task Force., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:e000155. doi: 10.1136/jitc-2019-000155图一：不同的组织多重免疫技术的比较

图二：使用多种抗体的多重免疫荧光技术（mIF）获取高内容成像数据：IBEX法获得的人肠系膜淋巴结共聚焦图像。比例尺（500或100µm）。 抗体标记靶蛋白分别为β-微管蛋白3（β-Tub3）、Ⅳ型胶原（Coll-IV）、纤维连接蛋白（Fibro）、层粘连蛋白（Lamin），和波形蛋白（Viment）

目前基于荧光标记的多重荧光组织免疫mIF/mIHC是探测肿瘤微环境应用最广泛的技术，泰立瑞信息专注于mIF/mIHC的相关技术，致力于将免疫染色（mIF/mIHC）、荧光图像采集和分析的自动化和智能化，研发用于mIF/mIHC的全自动免疫组化染色机（TR-Stainer）和荧光全切片扫描仪，其中TR-sWSI-5F荧光扫描仪是一款轻量入门级产品，具备快速5色扫描功能（蓝色DAPI、绿色FITC、黄色TRITC、红色Cy5、近红外Cy7），满足目前免疫荧光组化的绝大多数临床需求。而TR-sWSI-MF 的多光谱荧光扫描仪可以将多达15种颜色和自体荧光彼此得到很好的分离，从而使用户信心百倍地专注于量化真正发生的生物学相互作用，能够在整个切片上同时观察和测量组织的细胞，包括多种细胞表型。图三：泰立瑞荧光扫描仪（TR-sWSI-5F）

图四：泰立瑞全自动免疫组化染色机（TR-Stainer）