高通量筛选 "打开" 神经退行性疾病的药物开发之路 - MedChemExpress

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由于全球的老龄化趋势加剧，神经退行性疾病 (NDDs) 的患病风险逐渐升高，对 NDDs 病理靶标的发现及确认更是挑战满满。高通量筛选技术在神经退行性疾病中的大量应用无疑加快了相关药物的开发速度。今天我们就一起来了解一下吧~

神经退行性疾病 (Neurodegenerative diseases, NDDs) 是由中枢神经系统或周围神经系统神经元功能丧失，导致其功能障碍的一类神经系统疾病，通过影响记忆、认知、行为、感觉和运动功能，严重影响数百万患者的日常生活。


Tips：
高通量筛选利用自动化系统能够同时测试数千至数百万个样品，可在模型生物、细胞、或分子水平上验证生物活性，筛选已知结构的小分子化合物、化学混合物、天然产物、寡核苷酸和抗体等等。

本期由小 M 带着大家一起从 NDDs 的病理标志出发，学习一下高通量筛选在神经退行性疾病研究中的一些实例吧！



据 Wilson DM 3rd 在 Cell 上发表的综述“Hallmarks of neurodegenerative diseases ”报道，NDDs 的标志主要分为八大类：病理性蛋白的聚集、突触和神经元网络功能障碍、蛋白质稳态失衡、神经元细胞骨架异常、能量稳态失衡、脱氧核糖核酸和核糖核酸缺陷、炎症、神经元细胞死亡[1]。而这些标志也是开发 NDDs 相关药物的重要着手点。本期小 M 为大家主要介绍 NDDs 的其中三大病理标志。

图 1. 神经退行性疾病的分子学标志[1]。

首先咱们来说说作为 NDDs 关键病理标志之一的病理性蛋白的聚集。病理性蛋白的过度聚集具有神经毒性，会影响神经系统的正常功能。例如，在帕金森疾病中，大脑内 alpha-synuclein (α-syn) 异常沉积形成路易小体；阿尔兹海默症中，β-淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积导致的淀粉样斑块，Tau 微管结合蛋白磷酸化后形成神经元纤维缠结等。


接下来，我们就以 Tau 蛋白抑制剂的高通量筛选试验为例更直观地感受一下吧~

▐  应用：Tau 蛋白抑制剂的筛选
相较于传统的药物筛选，Dehdashti SJ 等人运用均相时间分辨荧光技术 (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF) 和 AlphaLISA 实验进行了快速、高效的高通量筛选，最终从 1280 个化合物中筛选出了 4 个能够抑制 SH-SY5Y 细胞中 Tau 蛋白水平的先导化合物，加快了 NDDs 中 Tau 蛋白抑制剂的筛选速度[2]。

图 2. AlphaLISA 和 HTRF 法检测 Tau 蛋白含量[2]。

(A) tau 蛋白测定的分步程序。将 SH-SY5Y 细胞接种在测定板中并孵育 4 小时，然后添加化合物。与化合物一起孵育 3 天后，裂解细胞并添加检测试剂 (AlphaLISA 或 HTRF)。孵育 2 小时后，使用读板器捕获信号。(B) AlphaLISA tau 测定原理图示。(C) HTRF 测定原理图示。

多种神经退行性疾病中有毒蛋白聚集体的积累与自噬-溶酶体途径（Autophagy-Lysosome Pathway, ALP，真核细胞中维持蛋白质稳态的途径之一）的缺陷有关，通过调节溶酶体功能的主调节因子 TFEB 可以改善多种神经退行性疾病模型的疾病表型。

▐  应用：TFEB /TFE3 的激酶调节因子筛选
今年 2 月，Carling PJ 等人使用高通量筛选从激酶抑制剂库中发现了具有神经保护作用的 TFEB 和 TFE3 的激酶调节因子。经过进一步的机制研究，作者发现喹唑啉结构类似物通过上调 CLEAR 基因的转录，清除 Huntingtin (HTT) 聚集体，从而调节溶酶体功能发挥抗神经损伤作用[3]。

图 3. 高通量筛选 TFEB 和 TFE3 的激酶调节因子[3]。

(A) 在所有测定中以 1 µM 筛选 490 种 PKIS2 化合物，并通过级联分析来鉴定无毒化合物。(B) AK 释放和 (C) 免疫细胞化学图像的核计数用于评估细胞毒性。(D) 活性溶酶体计数和 (E) 通过 DQ Red BSA 测定测量的校正荧光强度用于评估溶酶体毒性。对于 (F) 核 TFEB (% nTFEB) 和/或 (G) 核 TFE3 (% nTFE3) 易位。总共确定了 74 个阳性命中。

初筛时，作者使用 AK 含量测定发光试剂盒检测了化合物 (1 μM) 对人诱导多能干细胞 (hiPSC) 中腺苷酸激酶 (Adenylate kinase, AK) 含量变化 (图 3 B,C)，通过 DQ™ Red BSA 试剂检测溶酶体活性情况 (图 3 D,E)。根据 AK 含量和溶酶体活性结果，作者剔除了能够诱导细胞毒性或线粒体毒性的化合物。
复筛时，作者使用免疫细胞化学法 (ICC) 测定了不同化合物 (0.01-2 μM) 对 TFEB 和 TFE3 入核情况的影响 (图 3 F,G)，筛选出了 74 种能够显著促进 TFEB 或 TFE3 入核的化合物[3]。



神经元是一类对能量要求比较高的活跃细胞，能量代谢的紊乱会极大程度的影响神经元的正常功能，导致 NDDs 疾病的发生。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 是能量代谢过程中的一种重要辅酶，在维持神经元健康中发挥重要作用。

▐  靶向 NAMPT 的小分子激活剂筛选
Hong Yao 等人根据 NAD 代谢调控神经退行性疾病这一科学热点，通过高通量筛选和基于靶点结构的药物设计，筛选出了靶向NAMPT (Nicotinamide Phosphoribosyl Transferase, 烟酰胺磷酸核糖基转移酶，是 NAD 合成的一大关键限速酶) 的小分子激活剂 (NAT)，实验结果证明 NAT 能够通过促进 NAD 的生物合成，发挥神经保护作用[4]。

图 4. 高通量筛选鉴定一种新的NAMPT 激活剂[4]。

(A) 高通量筛选 NAMPT 激动剂的程序示意图。(B) 三偶联的 NAMPT 酶反应在室温下用 DMSO 或 10 μM 的 NAT 进行 20 分钟，开始时加入或不加入 NAM。(C) 在指定浓度的 NAT 或 NAT-5r 存在下进行 NMNAT1 酶测定。

首先，作者通过高通量筛选体外重组酶实验筛选出了数个能激活 NAMPT 的小分子。从中，作者选择了能强烈刺激 NAMPT 活性，但在 NMNAT (Nicotinamide Nucleotide Adenylyltransferas, 烟酰胺核苷酸腺苷酸转移酶) 测定实验中没有活性的小分子化合物 NAT。

接着，为改善 NAT 的药理学性质，作者对 NAT 进行了结构修饰和优化，共合成 81 种 NAT 衍生物。最后，作者在细胞水平及动物水平中验证 NAT 化合物的作用机制，发现 NAT-5r 通过有效提高细胞内 NAD 水平，并诱导随后的代谢和转录重编程过程，从而发挥神经保护作用。

这次小 M 从 NDDs 的病理特征出发，列举了三个高通量筛选技术应用于神经退行性疾病相关药物筛选的实例，生动的讲述了高通量筛选技术从理论到实际操作的一个运用，各位小伙伴们学会了嘛~

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神经退行性疾病化合物库 1,900+ 具有抗神经退行性活性的化合物或靶向神经退行性疾病主要靶点 (Amyloid-β，Dopamine Receptor，COMT 等)的化合物。

抗帕金森病化合物库 1,100+ 具有抗帕金森病活性的化合物及靶向帕金森病主要靶点 (Dopamine Receptor，LRRK2，5-HT Receptor 等) 的化合物。

神经信号化合物库 2,300+ 神经信号相关的小分子化合物，主要靶向 G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 和 Notch 信号，是研究神经调控及神经疾病的有用工具。

神经保护化合物库 900+ 具有潜在神经保护作用的化合物，主要靶向神经保护通路中的主要靶点，如钙离子通道，钠离子通道，腺苷 A1 受体等。

神经递质受体化合物库 1,600+ 神经递质受体相关的化合物，是神经系统疾病药物筛选的有效工具。

可透过中枢神经系统化合物库 800+ 被明确报道可以透过血脑屏障的小分子化合物，是开发脑部疾病药物如脑瘤、精神障碍和神经退行性疾病等有效的工具。 5-羟色胺受体化合物库 200+ 5-羟色胺 (5-HT) 受体抑制剂及激动剂，可用于多种精神类药物的开发。

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参考文献：
[1] Wilson DM 3rd, et al. Hallmarks of neurodegenerative diseases. Cell. 2023 Feb 16;186(4):693-714.
[2] Dehdashti SJ, et al. A high-throughput screening assay for determining cellular levels of total tau protein. Curr Alzheimer Res. 2013 Sep;10(7):679-87.
[3] Carling PJ, et al. Multiparameter phenotypic screening for endogenous TFEB and TFE3 translocation identifies novel chemical series modulating lysosome function. Autophagy. 2023 Feb;19(2):692-705.
[4]Yao H, et al. Discovery of small-molecule activators of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) and their preclinical neuroprotective activity. Cell Res. 2022 Jun;32(6):570-584.