肝细胞癌免疫组化诊断谱组合策略研究进展

晓晓

　　作者简介：冯龙海，丛文铭
　　来源：《临床与实验病理学杂志》J Clin Exp Pathol--2015 Feb;31(2)

　　摘要：免疫组化标志物为肝细胞癌的诊断和鉴别诊断提供重要的临床病理学依据，经过多年分析，国内外学者先后提出“HSP70 + GPC3 + GS”、“SUOX + AKR1B10 + CD34”等多种免疫组化诊断谱，该文现将这些免疫组化标志物及构成诊断谱最新研究进展作一综述。
　　免疫组化是诊断肝细胞癌的重要组织病理技术，特别是对难以确诊的高分化肝细胞癌(well-differentiatedhepatocellularcarcinoma，WD-HCC)具有重要的辅助诊断作用。肝细胞癌常用的免疫组化标志物有肝细胞石蜡抗原-1(hepatocyteparaffin antigen 1，HepPar-1)、磷脂酰胺醇蛋白聚糖3(GPC3)、热休克蛋白70(HSP70)和谷氨酰胺合成酶(GS)，新近发现的标志物有膜联蛋白A2、氨基酰化酶-1(ACY1)、亚硫酸盐氧化酶(SUOX)、正醛酮还原酶家族1B10(AKR1B10)等。对上述标志物进行单一检测时，往往缺乏足够的敏感性和(或)特异性，限制了实际应用。临床研究表明，多项标志物联合检测，构建免疫组化诊断谱，可有效弥补这一不足，近年研究提出的诊断谱详见表1。
　　1．HSP70+GPC3+GS和HSP70+GPC3+GS+CHC
　　HSP70、GPC3和GS三者均是肝细胞癌早期重要的诊断标志物。
　　HSP70属于热休克蛋白家族，参与肿瘤的发生，可促进肿瘤细胞增殖，直接影响肿瘤的发展进程。在肝细胞癌早期，HSP70表达水平上调，表达含量与癌前病变、非癌组织差异有显著性，是诊断早期肝细胞癌较为敏感的指标之一。最新研究发现，慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌患者血清HSP70水平呈现连续性、渐进性升高特点，且肝细胞癌患者HSP70水平显著高于正常人群和其他肝脏疾病患者，进一步肯定了HSP70作为肝细胞癌诊断标志物的价值。
　　GPC3为硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族成员，属于癌胚抗原。GPC3在局灶性结节增生等肝脏良性肿瘤结节中呈阴性，在肝细胞癌结节中呈阳性；若在异型增生结节中呈阳性，特别是高度异型增生结节，提示该结节已处于肝细胞癌癌前病变晚期阶段，具有向肝细胞癌转变的高风险倾向。血清GPC3水平能显著提高血清AFP阴性患者肝硬化结节的肝细胞癌的确诊率，但其是否能代替AFP作为肝细胞癌新的诊断标志物，仍需大量临床实践论证。
　　GS是哺乳动物体内催化谷氨酰胺合成的关键酶，该酶在肝脏特别是在肝小叶中央静脉周围活化的肝母细胞(activatedhepatocyte progenitorcells)中高表达，其终产物谷氨酰胺是肿瘤细胞新陈代谢的重要能源物质。GS在肝硬化结节、异型增生结节和肝细胞癌结节等多种肝脏结节性病变中异常表达。研究发现，HCV相关性肝细胞癌早期患者的GS表达水平及磷酸化水平增高，并且产GS的癌细胞以结节内结节的方式生长于肿瘤中。GS在早期肝细胞癌组织中的阳性率为70%，对于AFP表达水平较低的早期肝细胞癌患者(AFP＜200 ng/ml)，GS具有良好的辅助诊断价值。在肝细胞癌发展过程中，转录GS的mRNA、蛋白及活性明显增高，在异型增生结节→早期肝细胞癌→晚期肝细胞癌过程中，GS表达水平逐步上升，并可增强癌细胞转移能力，同时也是肝细胞癌复发的独立预后指标。
　　CHC属于内皮性标志物，在恶性肝细胞癌胞质中过表达，在非恶性病变中常呈阴性、部分细胞呈轻～中度阳性。CHC协同铵甲基四氢叶酸环化脱氢酶(formiminotransferasecyclodeaminase，FTCD)可提高GPC3阴性早期肝细胞癌的检出率。
　　HSP70、GPC3和GS诊断谱由Tommaso等学者在研究eHCC-G1的病理诊断时首先提出，并对其手术切除标本、肝脏穿刺活检组织进行了多次临床研究论证(表2)。在手术切除的肝脏肿瘤标本中，约43.7%的eHCC-G1组织3项指标均阳性，另有3%eHCC-G1组织3项指标均阴性，当3项标志物中至少任意2项为阳性时，此时的诊断敏感性、特异性和准确率最佳，分别为71.9%、100.0%和83.3%。在肝脏穿刺活检组织中，该免疫组化谱诊断WD-HCC的敏感性和准确率均有所下降，但特异性仍为100.0%。Tommaso等又在前期研究的基础上增加1项标志物CHC，构建“HSP70+ GPC3 + GS + CHC”4项免疫组化诊断谱，研究发现“HSP70+ GPC3 + GS”诊断谱对肿瘤直径≤2cm的G1级分化肝细胞癌的诊断敏感性和准确率分别低至33.3%和56.5%，新增CHC标志物后可将诊断敏感性提高至50.0%，准确率提高至67.4%，特异性仍为100%。Tremosini等亦对瘤体直径≤2 cm 的G1级分化肝细胞癌进行了“HSP70 + GPC3 +GS”诊断研究，发现至少任意2项指标阳性时，该谱的敏感性和准确率最佳，分别为52.6%和77.0%，特异性为100%。从上述多个独立诊断实验研究中不难发现，“HSP70 + GPC3+ GS”诊断谱具有极高的诊断特异性，但敏感性和准确率不稳定，诊断评价效果波动较大，仍需大量临床病理诊断反复研究论证。
　　2．ACY1+SQSTM1+CD34和ACY1+SQSTM1+GPC3
　　ACY1即由ACY1基因编码的同源二聚体锌结构氨基酰化酶，具有催化L型乙酰化氨基酸水解为乙酰基团和相应的L型自由氨基酸的功能，参与细胞内蛋白的分解代谢，但人类ACY1具体结构仍不清楚。ACY1几乎表达于所有的有核细胞，在肾和脑组织中高表达，在小细胞肺癌、肾透明细胞癌、结直肠癌等多种肿瘤组织内异常表达。约80.3%小肝细胞癌(smallhepotocelluar carcinoma，SHCC)组织中ACY1呈阴性；与此相反，在约93.3%的异型增生结节组织中呈阳性，这使其成为肝细胞癌潜在的诊断标志物，也是首次探究ACY1表达与肝细胞癌的关系。SQSTM1即编码p62蛋白的基因，该蛋白是一种多功能泛素样结合蛋白，是肝脏Mallory小体和透明小体的重要组成部分，可通过促进ABT-263介导的Caspase-8聚集介导自噬，参与信号转导、细胞增殖、生存和凋亡，是自噬活动的重要指标，为肝细胞癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤潜在的致癌因子。与ACY1不同，在肝细胞癌结节中p62蛋白多呈阳性(阳性率为79.6%)，在异型增生结节中则以阴性表达为主，偶见阳性反应(阳性率为13.3%)；p62蛋白可通过JNK和ERK1途径介导脂肪变，调节NRF2、NF-κB、mTOR等多种信号路径的下游效应因子活性，而SQSTM1本身又是NRF2的靶基因，二者之间存在正反馈环路，共同影响肝细胞癌的发展进程，p62蛋白表达水平与ACY1类似，与肝细胞癌组织分化程度无明显相关性。CD34是肿瘤新生血管标志物之一，正常肝血窦内皮细胞不表达内皮细胞标志物CD34，肝细胞癌窦样血管内皮表达CD34，早期肝细胞癌组织中CD34呈广泛、窦隙状强阳性表达，高于非肝细胞癌组织，有助于两种组织的鉴别诊断。
　　“ACY1 + SQSTM1 + CD34”、“ACY1 + SQSTM + GPC3”及后述的“SUOX + AKR1B10 + CD34”免疫组化诊断谱均是第二军医大学东方肝胆外科医院病理科在WD-SHCC诊断系列研究中，利用iTRAQ-2DLC-ESI-MS/MS技术筛选出的新标志物和组建的新型免疫组化谱。“ACY1 + SQSTM1 + CD34”诊断谱主要用于异型增生结节和SHCC的鉴别诊断，敏感性和特异性分别为96.1%和98.0%，准确率达96.3%。在此基础上提出的“ACY1 + SQSTM + GPC3”免疫组化谱用于诊断WD-SHCC，该谱诊断敏感性为93.8%，特异性为95.2%。另外，该项研究还发现，AFP阳性而GPC3免疫组化染色呈弱阳性的肝细胞癌患者预后不良，是肝细胞癌潜在的预后评估指标。
　　3．SUOX+AKR1B10+CD34
　　SUOX即亚硫酸盐氧化酶，是SUOX基因编码的线粒体内酶系组成部分，参与体内亚硫酸转换为硫酸盐的反应，若该基因缺乏，则体内亚硫酸堆积，影响神经系统功能，甚至导致死亡，临床称之为亚硫酸氧化酶缺乏病，属于一种罕见的常染色体隐性遗传病。在肝脏慢性疾病的相关研究过程中，发现SUOX抗体的存在，特别是原发性硬化性胆管炎患者，约33%的病例可检测到SUOX抗体，熊去氧胆酸(UDCA)治疗后，SUOX抗体水平降低。非酒精性脂肪性肝病的早期阶段可检测到SUOX水平的改变；在肝细胞癌中，SUOX表达程度具有随肝细胞癌组织分化水平降低而降低的协同效应，即肝细胞癌组织分化越差，SUOX表达水平越低。AKR1B10是正醛酮还原酶家族中单分子醛糖还原酶，该酶可减少细胞内醛、铜类物质堆积，具有解毒作用，在子宫颈癌、小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌中亦有表达。在脂肪性肝病组织中，AKR1B10过表达，这可能是通过EGF和胰岛素通过转录因子-1信号途径实现的，该特点使其成为脂肪肝向肝细胞癌演变的潜在监测指标。最新研究表明，AKR1B10在慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌癌前病变组织中均有表达，且表达水平与脂肪变性有关。在丙肝相关性肝细胞癌组织中，AKR1B10上调与血清AFP水平升高密切相关，提示AKR1B10参与早期肝细胞癌的形成。AKR1B10在肿瘤早期阶段过表达，中晚期阶段以及癌组织差分化时低表达，该特性使AKR1B10具备作为早期肝细胞癌分化程度监测和病情转归标志的潜能。
　　“SUOX + AKR1B10 + CD34”免疫组化诊断谱中SUOX在肝细胞癌发生演进过程中表达水平逐渐降低，在WDSHCC和中分化肝细胞癌组织中的表达水平明显低于肝硬化、低度异型增生结节和高度异型增生结节组织，AKR1B10和CD34的表达水平与之相反。该诊断谱诊断WD-SHCC的敏感性和特异性分别为93.8%和95.2%，整体准确率达94.2%，是目前诊断评价效果最佳的免疫组化诊断谱。同时，SUOX可以作为肝细胞癌患者总生存期和复发时间的独立预后指标。
　　综上所述，免疫组化标志物及构建的诊断谱对癌组织呈高度分化，仅依靠组织病理诊断难以确诊的WD-HCC具有重要的诊断价值，为实现肝细胞癌早确诊、早治疗提供可靠的临床依据。现有的免疫组化诊断谱诊断评价效果不稳定，缺乏多中心、大样本的临床研究反复论证。因此，如何节约成本，择取更加敏感和特异的免疫标志物，构建最佳组合方案，将是肝脏临床肿瘤免疫组化病理诊断探索的重要内容之一。

小王

:handshake