石蜡组织切片抗酸染色方法的改良体会

山蒙蒙

　　作者：王弦，吴强

　　来源：《临床与实验病理学杂志》

　　齐尼（ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ）抗酸染色法的原理是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸乙醇处理后不脱色，其后再加碱性美蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。因其成本低、操作简单且无需专门仪器设备，对结核病的监测和检测起重要作用。但在实践工作中发现不同医院的抗酸染色法操作差异较大，阳性率较低，给诊断造成了一定的困难。作者在日常病理工作中，运用齐尼抗酸染色法检测组织切片中的结核杆菌，并将染色方法进行改良，效果良好，现介绍如下。

　　１．材料与方法

　　１．１　试剂

　　（１）ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ酚品红液：碱性复红２.５ｇ，蒸馏水２５０ｍｌ，无水乙醇１０ｍｌ，苯酚（被溶化）１２.５ｍｌ。充分混合后，过滤置于棕色瓶内，稳定期１年。

　　（２）１％盐酸乙醇：盐酸１０ｍｌ，７０％乙醇９９０ｍｌ。充分混合，稳定期１年。

　　（３）甲基蓝储存液：甲基蓝０.７ｇ，蒸馏水５０ｍｌ。充分混合后，过滤置于瓶内，稳定期１年。

　　（４）甲基蓝工作液：甲基蓝储存液５ｍｌ，蒸馏水４５ｍｌ。倒入立式染色缸，稳定期２个月。

　　１．２　方法

　　（１）石蜡标本５～６μｍ厚切片；

　　（２）汽油和松节油混合液脱蜡至水；

　　（３）ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ酚品红液常温染色２０ｍｉｎ或酒精灯加热染色５ｍｉｎ；

　　（４）自来水冲洗；

　　（５）１％盐酸乙醇漂洗褪色至淡红色，停止脱色；

　　（６）自来水洗５ｍｉｎ；

　　（７）蒸馏水漂洗；

　　（８）甲基蓝工作液３０ｓ；

　　（９）自来水洗，吹风机吹干封片。

　　２．结果

　　改良尼抗酸染色结果显示：抗酸杆菌呈鲜红色，背景呈淡蓝色（图１）。

　　３．讨论

　　结核病的特征性病理改变是肉芽肿性病变和结核结节，其基本病理变化为渗出性病变、增生性病变和坏死性（变质性）病变。要确诊是否由结核杆菌感染导致的病变，在患者体液及相关组织切片中找到结核杆菌才是诊断的“金标准”。

　　结核杆菌的抗酸染色性与菌体表面索状结构内所含的肽糖脂分枝酸残基和胞壁固有层的完整性有关。碱性复红同分枝酸残基牢固结合形成复红－分枝酸复合物，用盐酸乙醇漂洗褪色时能够抵抗稀酸的漂洗，难以将染料从复合物中再溶解而渗入菌体。对于齐尼抗酸染色法，在染色中注意细节上的改进，提高阳性率，可更好的服务于诊断与临床：

　　（１）在齐尼抗酸染色实验中，５％石炭酸复红加热可以缩短反应时间，并且可以增加结核杆菌的阳性检出率。但是，在加温过程中，也存在一些不利因素，如日常的加热多采用酒精灯加热法，易造成染液溅起，并且易出现加热不均匀，边缘出现染液干涸，影响制片质量；结核杆菌本身就是通过空气为传播媒介，加温产生的气溶胶更容易危害人体。基于此，在实验工作中适当延长反应时间，也取得了良好的染色效果。经过实验观察与验证，常温染色２０ｍｉｎ以上，基本可

　　以达到与加温染色相同的效果。延长时间在检出率及菌量上与加温染色无显著差异。在基层工作中，可以考虑通过延长染色时间达到染色效果，减少加热过程带来的不利影响。

　　（２）为使切片尽可能的含有更多的抗酸杆菌，抗酸染色的石蜡组织切片可适当偏厚（５～６μｍ），可以提高结核杆菌的阳性检出率，但同时烤片和脱蜡的时间需相对延长。

　　（３）运用汽油和松节油的等量混合液来代替二甲苯进行脱蜡，可以明显提高染色的阳性率，因为汽油和松节油脱蜡可以保护菌体脂质不受破坏和菌体壁的完整性，如果菌体壁的完整性被破坏，其抗酸性随之就会减弱或消失，所以染色就有可能失败或者阳性率降低。

　　（４）在抗酸染色的分化阶段，如果分化不足，染色背景较暗，而染色较浅的抗酸杆菌就很难被“捕捉”到。因此当观察到切片上仍然有红色背景时，则需要继续分化直到切片无红色为止。为使切片分化均匀，尤其是组织较大时，作者建议采用浸没分化的方式，分化液的浓度可适当调低，以便更好的控制反应速度。同时，我们应掌握好复染时间，如果背景过深，也会影响结核杆菌的镜下观察，这时可以使用低浓度乙醇脱色，效果良好。

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问心

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病理科_w

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