细胞冻存与复苏

为止

作者：解螺旋.毛博
来源：解螺旋，医生科研助手

很多时候，我们需要把细胞冷冻起来，以便于长期保存，以备不时之需。而复苏，就是使冷冻的细胞苏醒过来，恢复活力。

其实，细胞冻存和复苏的protocol教科书和实验手册上面都有。毛博我不想再重复了。这里，毛博根据自己做细胞培养近10年的经验和体会，谈谈应该注意的一些事项和技巧，大部分都是血泪教训和经验总结。都是干货哟。

1、冷冻越慢越好，复苏越快越好
高大上的实验室可以使用程序冷冻仪。一切由机器代劳。屌丝实验室就只好用人肉程序冷冻仪。具体的protocol，到处都有。毛博想提醒大家的是，细胞冷冻越慢越好，宁慢勿快。做细胞冷冻前，事先留出充足的时间。

而复苏速度越快越好。从液氮罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，然后使劲摇呀摇。令其尽快融化。

2、高高兴兴上班，平平安安回家
细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出事的部分。凡是和液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。最需要小心的是：复苏的时候，在水浴中摇呀摇的时候。有时候小瓶会爆炸的。所以，一定要戴保护眼镜和手套。不多说了，说多了满眼都是泪。还有，冻存液中的DMSO是有毒致癌的。接触的时候一定一定要带好手套。

3、冻存细胞数量要足够
无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般最低要达到5×106/毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如杂交瘤细胞，只需要1-3x106/毫升。

4、做好标记
把培养瓶放入提手，末端应该扎有小牌，注明主人的名字，细胞名称和冻存日期。还要在每个冻存管上写上细胞名称，代数和冻存日期。

实验室的液氮罐都是公用的。每个人应该有属于自己的提手。毛博当年就发生过为了找自己的细胞，被迫把整个液氮罐翻了个底朝天的惨剧。

5、细心呵护
刚刚复苏的细胞就象刚刚出生的baby，非常脆弱。需要我们的细心呵护。培养液要事先在培养箱或者水浴中复温。一切的和细胞接触的动作都要轻柔。把细胞从冻存管里吸出来，注入离心管，要轻轻地吸取和滴加。包括给离心管补加培养液的时候，都要轻轻地滴加。离心要用低速离心（500-1000转/分钟）。吹打要用专用的吹打管，而不要图方便用移液枪，吹打也要轻轻的。

6、DMSO的问题
上面提到了DMSO是一种有毒致癌物质。那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的DMSO呢？答案是no。除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99%的细胞都不需要去除DMSO。解冻后的频繁换液会慢慢去除掉DMSO的。

7、物离乡贵，人离乡贱
解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡。这和一个人突然离家千里，会水土不服是一样的道理。

细胞培养是个苦活，根本离不开人。毛博还记得当年当实验狗的时候，放个长假都要惦记着培养箱里面的细胞是不是该换液了。而掌握了有效的冻存和复苏的技术，就可以解决这个问题。春节回家前把细胞都冻上，过了年回来再开干。

就爱小小酥

最近我的细胞复苏后总是出现问题。冻存是细胞状态很好。我是如下操作的，请大家帮忙看一下到底存在哪些问题：
复苏时：从液氮罐取出细胞后1min内在37度水浴化冻，置于超净台，我没有离心，将细胞吹开后移入装有完全培养基的培养瓶。（离心与否好像关系不大，隔天换液就可以去除DMSO）。
冻存时：我的冻存液是9:1的小牛血清+sigma公司的DMSO。细胞悬液离心用用冻存液吹打，置于冻存管，然后梯度降温：4度10min，-20度30min，超低温冰箱过夜，置于液氮罐。就是这样。
但是细胞复苏后就是不好，不知道为什么，请大家帮忙。

扪心问诊

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