BRAF和RAS基因突变在甲状腺乳头状癌不同组织亚型中的表达

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：王炜 黎向红 项晶晶 赵盼 周虹 徐如君
根据肿瘤有无明确的乳头状结构，甲状腺乳头状癌（PTC）通常被分为经典型和滤泡亚型[1]，而根据肿瘤有无完整的包膜包绕，PTC又被分为浸润性和包裹性，包裹性PTC有完整的纤维包膜包绕，预后比浸润性PTC更好[1,2]。BRAF、RAS基因的突变与甲状腺癌发生有着密切的联系[3,4]，BRAF V600E突变在PTC中高表达，与PTC的发生和不良预后关系密切；而RAS基因（包括HRAS、KRAS、NRAS）的突变则高表达于甲状腺滤泡性肿瘤中[1,4]。我们使用PCR测序法和扩增阻碍突变系统（ARMS）分析133例PTC中BRAF V600E和RAS基因密码子12、13、61突变的表达，探讨PTC不同组织学分型的分子特征。
一、材料与方法
　　1.研究对象：
　　选取2013年1月至2014年3月在杭州市第一人民医院手术的133例PTC病例作为研究对象，根据肿瘤有无完整纤维包膜包绕以及明确的乳头状结构，将其分为：包裹性经典型（EC－PTC）21例（图1）、包裹性滤泡亚型（EFV－PTC）12例（图2）、浸润性经典型（IC－PTC）79例（图3）、浸润性滤泡亚型（IFV－PTC）21例（图4）。分析各型之间发病年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、甲状腺包膜外侵犯、临床分期等临床病理参数的差异。
图1～4甲状腺乳头状癌　HE　中倍放大；图1　包裹性经典型，肿瘤有完整纤维包膜包绕，可见明确的乳头状结构；图2　包裹性滤泡亚型，肿瘤有完整纤维包膜包绕，仅由滤泡状结构构成；图3　浸润性经典型，肿瘤可见明确的乳头状结构，在甲状腺组织内浸润性生长；图4　浸润性滤泡亚型，肿瘤仅由滤泡状结构构成，无包膜包绕，向甲状腺外脂肪组织浸润性生长。

　　2.突变检测：
　　采用PCR测序及ARMS法检测样本BRAF V600E及HRAS、KRAS、NRAS基因密码子12、13、61突变的表达。PCR产物送厦门艾德生物医药科技有限公司测序（ABI 3500Dx型测序仪），而33例包裹性PTC以及17例测序结果可疑的浸润性PTC再使用ARMS法（安捷伦Mx3000p型荧光定量PCR仪）进行BRAF V600E和KRAS密码子12、13位点突变的检测。

　　二、结果
1.PTC各分型临床病理参数之间差异分析（表1）：
表1 甲状腺乳头状癌各组织学分型的临床病理参数及BRAF、RAS突变的表达（例）

　　包裹性PTC中未发现淋巴结转移、甲状腺包膜外侵犯并有着更低的临床分期，与浸润性PTC相比差异均有统计学意义（均P<0.05）。IC－PTC的肿瘤直径相对更大，但差异无统计学意义（均P>0.05）；PTC各型之间发病年龄和性别分布的差异无统计学意义（P>0.05）。

　　2.BRAF和RAS基因突变在PTC中的表达情况：
　　133例PTC中共检出BRAF和RAS基因突变93例（发生率69.9%），包括BRAF V600E突变79例（发生率59.4%），其中6例测序可疑的或未检出的突变经ARMS法检出，约占检出率的7.6%；RAS突变14例（发生率10.5%），其中HRAS 61突变9例、NRAS 61突变5例；未发现同一个病例中存在BRAF和RAS基因双突变。79例BRAF V600E突变均为1799T>A；9例HRAS 61突变则存在2种突变型：181C>A、182A>G；5例NRAS
61突变均为182A>G。此外，133例PTC中均未发现RAS基因12、13密码子的突变，同时也未发现KRAS 61的突变。

　　3.BRAF和RAS基因突变在PTC各亚型中的分布（表1）：
　　PTC各型中BRAF V600E突变阳性的分布为，EC－PTC（14/21，66.7%）、EFV－PTC（0/12，0%）、IC－PTC（55/79，69.6%）、IFV－PTC（10/21，47.6%）；而RAS突变阳性的分布为，EC－PTC（0/21）、EFV－PTC（7/12）、IC－PTC（3/79，3.8%）、IFV－PTC（4/21，19%）。BRAF V600E和RAS突变在包裹性PTC和浸润性PTC中的表达有显著差异，浸润性PTC中高表达BRAF V600E突变；RAS突变则高表达于包裹性PTC中（P值均<0.05）。BRAF V600E和RAS突变在经典型PTC和滤泡亚型PTC中的表达有显著差异，经典型PTC中高表达BRAF
V600E突变；滤泡亚型PTC则高表达RAS突变（P值均<0.05）。

　　4.BRAF和RAS基因突变与PTC临床病理参数之间的相关性分析：
　　存在BRAF V600E突变的PTC患者相对年龄更高、更容易出现甲状腺包膜外侵犯和淋巴结转移，但差异无统计学意义（均P>0.05）；而存在RAS突变的PTC患者的淋巴结转移率（1/14）要显著低于RAS野生型的PTC患者（39/119），差异有统计学意义（P<0.05）。

　　三、讨论
　　通过分析BRAF、RAS基因突变的表达，我们探讨了PTC可能与之相关的组织学特征。本研究中，存在BRAF V600E突变的PTC在组织学上多以"经典型"和"浸润性"为表现；而有RAS突变的PTC则更易出现"滤泡亚型"和"包裹性"的形态，尤其是EFV－PTC甚至不表达BRAF V600E突变而只高表达RAS突变。BRAF V600E突变的PTC患者往往年龄更高、更容易出现甲状腺包膜外侵犯和淋巴结转移、有着更高的临床分期；相比之下RAS突变的PTC患者则很少发生淋巴结转移。

　　近年来EFV－PTC已渐成为研究热点，关于它的命名和分类仍有争议，有人认为"EFV－PTC"的名称根本就是个错误[5]，在明确其恶性生物学行为之前不应该称之为"癌"，还有人建议将其定义为"具有不确定恶性潜能的高分化肿瘤（WDT－UMP）"而独立划分出来[2]。我们的研究在分子特征上支持这种划分。本研究中EFV－PTC不表达BRAF V600E突变（0/12），而高表达RAS突变（7/12），这与其他类型的PTC明显不同。与甲状腺滤泡性肿瘤相似，EFV－PTC高表达RAS突变，但一个有趣的现象须重视，本研究133例PTC（包括EFV－PTC）中发现的14例RAS突变均在61密码子上，而缺乏12、13密码子突变，这一情况也出现在新近的一些研究中[6,7,8]。而甲状腺滤泡性肿瘤中RAS突变不仅有61密码子突变，还有并不少见的12、13密码子突变[9]，这表明EFV－PTC与甲状腺滤泡性肿瘤的分子表型在一定程度上仍有差异。总之，EFV－PTC（或称为WDT－UMP）的分子特征有独特之处。

　　虽同为包裹性PTC，EC－PTC的分子表型与EFV－PTC完全不同，高表达BRAF V600E突变，低表达RAS基因突变，却与IC－PTC更相似。此外，滤泡亚型PTC中一般低表达BRAF V600E突变[4]，本研究也不例外，可如果把EFV－PTC排除，IFV－PTC中BRAF V600E的突变率（47.6%，10/21）虽低于经典型PTC（69.0%，69/100），但差异无统计学意义（P>0.05）。因此，滤泡亚型PTC低表达BRAF V600E突变的因素中，EFV－PTC占了较大的权重。

　　综上所述，存在BRAF V600E突变的PTC在组织学上多以"经典型"和"浸润性"为表现；而有RAS突变的PTC则更易出现"滤泡亚型"和"包裹性"的形态。EFV－PTC有独特的分子表型，将其划分出来有分子生物学基础。导致滤泡亚型PTC低表达BRAF V600E突变的因素中，EFV－PTC占了较大的权重。PTC中缺乏RAS基因12、13密码子突变是个有趣现象，有待进一步研究。