Lynch综合征，又称为遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer)，属于常染色体显性遗传性疾病，由DNA错配修复基因突变引起。除肠癌外，女性患者中子宫内膜和卵巢是肠外恶性肿瘤最好发的部位[[url=]1[/url]]。部分Lynch综合征患者以子宫内膜癌、卵巢癌(主要是透明细胞癌和内膜样腺癌)为首发肿瘤，这些肿瘤被称为Lynch综合征相关的妇科肿瘤，可作为Lynch综合征首发或前哨的临床表现[[url=]2[/url],[url=]3[/url]]。Lynch综合征相关的分子检测已有部分病理科开展，但相比较而言，错配修复蛋白的免疫组织化学检测更容易在日常工作中实施。错配修复蛋白表达检测可作为Lynch综合征的筛查手段，但目前国内相关研究少见[[url=]4[/url],[url=]5[/url],[url=]6[/url]]。我们应用免疫组织化学方法对150例子宫内膜癌中错配修复蛋白的表达情况进行了检测，并与临床病理参数进行相关性分析，旨在使病理医师熟悉错配修复蛋白表达异常的子宫内膜癌的临床病理特点，以有利于Lynch综合征相关患者的进一步筛选。
资料与方法
1．临床资料：
收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2014年12月至2015年8月的子宫内膜癌连续病例，共计150例子宫内膜癌根治术标本，复阅HE切片及诊断。通过临床病史及问询患者获取家族肿瘤病史及随访信息。
2．方法：
标本经4%中性甲醛液固定、脱水、包埋、切片和HE染色。免疫组织化学均采用Ventana Benchmark XT自动免疫组织化学仪(购自Ventana公司)染色。一抗采用Roche公司的错配修复抗体，包括鼠单克隆抗体MLH1(克隆号：G168-728)、鼠单克隆抗体MSH2(克隆号：G219-1129)、鼠单克隆抗体MSH6(克隆号：44)、兔单克隆抗体PMS2(克隆号：EPR3947)。以每张切片中淋巴细胞的胞核阳性为内对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
3．病理检查：
通过大体观察记录肿瘤位置，分为子宫腔、子宫体下段，其中宫体下段是指肿块以子宫体下段为中心，而不是起源于宫体或宫颈延伸至宫体下段[[url=]7[/url]]。复阅HE切片，观察以下形态特点：(1)肿瘤周围有显著的淋巴细胞浸润([url=]图1[/url])，是指在低倍镜下容易观察到肿瘤周围有显著淋巴细胞围绕[[url=]8[/url]]。(2)肿瘤内浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL；[url=]图2[/url])，仅指位于肿瘤细胞巢内或肿瘤腺体内的淋巴细胞，不包括间质内淋巴细胞或凋亡小体。在淋巴细胞浸润最多的区域计数至少10个高倍镜视野，≥42个淋巴细胞/10 HPF被定义为肿瘤具有TIL[[url=]7[/url],[url=]8[/url]]。(3)肿瘤具有异质性([url=]图3[/url]，[url=]图4[/url])，是指2种截然不同的病理形态共存，不同区域形态不同，每种成分所占比例至少要达10%[[url=]7[/url],[url=]8[/url]]。
图1
子宫内膜样腺癌周围见显著的淋巴细胞浸润，呈带状包绕癌巢 HE 低倍放大
图2
肿瘤内淋巴细胞浸润(TIL) HE 高倍放大
图3
子宫内膜样腺癌(右下)，灶区去分化(左上)，分化较好的腺癌与未分化成分截然分开，相互不混合 HE 低倍放大
图4
去分化的癌组织由片状、实性、条索状肿瘤细胞构成，无任何腺样结构分化 HE 中倍放大
图5
MSH6缺失表达，周围淋巴细胞呈阳性 HE 中倍放大
图6
伴有TIL，肿瘤细胞PMS2缺失表达，但浸润肿瘤内的淋巴细胞阳性，易判读为PMS2阳性表达HE 高倍放大
4．结果判读：
错配修复蛋白在肿瘤细胞核内明确着色视为阳性，任何肿瘤细胞的阳性均视为阳性[[url=]7[/url]]。肿瘤细胞核不着色时判读为阴性([url=]图5[/url]，[url=]图6[/url])。淋巴细胞阳性为内对照。
5．统计学分析：
实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计，均数比较采用t检验，计数资料比较采用Pearson卡方检验和Fisher精确概率法，P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1．一般临床资料：
150例连续子宫内膜癌患者，除9例未行盆腔淋巴结清扫术，其余患者均行子宫内膜癌根治术。患者年龄30～84岁，平均年龄55岁，中位年龄56岁。其中Ⅰ型子宫内膜癌(子宫内膜样腺癌1～3级)共131例，平均年龄54岁。Ⅱ型子宫内膜癌共16例，其中浆液性癌13例(平均年龄61岁)，透明细胞癌1例(年龄78岁)，癌肉瘤2例(平均年龄56岁)。Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌混合型3例，平均年龄58岁。Ⅰ型子宫内膜样腺癌病理分级比例分别为Ⅰ级58例(44.3%)，Ⅱ级60例(45.8%)，Ⅲ级13例(9.9%)。临床分期：131例Ⅰ型子宫内膜样腺癌中Ⅰ期110例(84.0%)，Ⅱ期7例(5.3%)，Ⅲ期13例(9.9%)，Ⅳ期1例(0.8%)。13例浆液性癌临床分期分别为Ⅰ期8例(8/13)，Ⅱ期1例(1/13)，Ⅲ期3例(3/13)，Ⅳ期1例(1/13)。1例透明细胞癌临床分期为Ⅰ期。2例癌肉瘤，临床分期均为Ⅰ期。混合型癌3例，临床分期分别为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期。
2．错配修复蛋白表达结果：
107例错配修复蛋白表达均质，未见异质性表达。43例错配修复蛋白表达缺失的子宫内膜癌可以表现为单个蛋白表达缺失，也可以是特定组合的2个蛋白联合表达缺失。本组错配修复蛋白表达缺失43例(28.7%，43/150)，其中MLH1/PMS2配对缺失27例(18%，27/150)，MSH2/MSH6配对缺失7例(4.7%，7/150)；PMS2单独缺失3例(2%，3/150)，MSH6单独缺失6例(4%，6/150)。
3．错配修复蛋白表达缺失与临床病理参数的相关性分析([url=]表1[/url])：
 | 表1
150例子宫内膜癌错配修复蛋白表达状态及临床病理参数[例(%)]
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(1)错配修复蛋白表达缺失患者更常见合并其他部位恶性肿瘤(卵巢透明细胞癌2例、肠癌1例)，错配修复蛋白正常表达组未合并其他部位的恶性肿瘤，差异具有统计学意义(P＝0.022)。(2)错配修复蛋白表达缺失组比正常表达组更常见以下2项病理形态特征：TIL≥42/10 HPF(P＝0.033)和显著的肿瘤周围淋巴细胞带(P<0.001)。此外，表达缺失组肿瘤浸润深度常<1/2肌层(P＝0.039)。(3)错配修复蛋白表达状态与年龄、恶性肿瘤病史、遗传性非息肉性结直肠癌相关家族史、肿瘤是否位于子宫体下段、组织病理类型、子宫内膜样腺癌分级、肿瘤异质性、淋巴结有无转移和临床分期等临床病理参数无相关性(P>0.05)。
4．肿瘤病史及家族史分析：
本组病例中直系亲属及患者本人患有恶性肿瘤的共12例，其中3例患者本人有结直肠癌病史，2例患者直系亲属有结直肠癌病史，3例患者直系亲属有胃癌病史，4例直系亲属患有其他恶性肿瘤(2例子宫内膜癌、1例肝癌、1例胰腺癌)。6例患者错配修复蛋白表达缺失(缺失组)，平均年龄50.5岁，<50岁者4例。6例错配修复蛋白表达者(表达组)平均年龄63.3岁，无<50岁的患者。两组<50岁患者比例差异具有统计学意义(P＝0.014)。缺失组中5例可见肿瘤周围淋巴细胞带，而正常组中仅1例可见，差异有统计学意义(P＝0.021)。肿瘤内淋巴细胞浸润及肿瘤异质性2项病理特征在两组间差异无统计学意义(P>0.05；[url=]表2[/url])。肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期在两组间差异均无统计学意义。
 | 表2
12例具有遗传性非息肉性结直肠癌家族史患者的临床病理参数及错配修复蛋白表达状态(例)
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讨论
错配修复基因的表达和突变检测作为Lynch相关肿瘤的筛查方法，在国际上已被规范地应用于结直肠癌患者[[url=]9[/url]]。但对Lynch综合征相关的妇科肿瘤的筛查模式尚无定论。目前的筛查主要针对子宫内膜癌，筛查年龄有的设定为50岁以下[[url=]10[/url],[url=]11[/url]]，有的设定为60岁以下[[url=]12[/url]]，也有学者认为不设年龄限制的普遍筛查是最佳方案[[url=]13[/url]]。甚至有研究指出年龄>60岁的患者38%～42%有Lynch综合征[[url=]14[/url],[url=]15[/url]]。患者年龄不超过70岁时，错配修复基因突变患者罹患子宫内膜癌的几率依次为54%(MLH1突变)、21%(MSH2突变)和16%(MSH6突变)，患者年龄不超过40岁时，无论何种错配修复基因突变，其患子宫内膜癌的几率均不超过2%[[url=]16[/url]]。新近一项基于605例子宫内膜癌连续病例的研究表明，错配修复蛋白表达缺失病例中有25%发生于<50岁的患者[[url=]17[/url]]，与本研究结果相似。我们结合临床遗传背景进一步分析，发现具有相关肿瘤家族史的病例中，错配修复蛋白表达缺失更常见于<50岁的患者(P＝0.014)。此外，在连续子宫内膜癌病例中错配修复蛋白表达缺失与年龄无明显相关性，与部分报道一致。但结合遗传学背景，同时具有相关肿瘤家族史及错配修复蛋白表达缺失的患者(可疑Lynch综合征患者)，更多见于50岁以下患者。
错配修复蛋白可表达于子宫内膜癌组织、淋巴细胞、间质细胞的细胞核中，有时癌组织中阳性染色并不均匀，会有局部表达缺失或胞质着色，但任何一个肿瘤细胞的核阳性都应视为错配修复蛋白表达[[url=]7[/url]]，而胞质着色则判为阴性。因此，对于表达缺失明显的病例，要仔细辨认阳性细胞是肿瘤细胞，还是浸润在肿瘤内的淋巴细胞，以免造成结果判读的偏差。新近有报道MSH6蛋白在罕见情况下可出现异质性表达[[url=]18[/url]]，在散发病例和遗传性病例中均可出现此种情况。本组病例未见MSH6的异质性表达。对于特别表达模式的病例，应当在病理报告中予以注明，以备进一步检测和研究。
本组错配修复蛋白表达缺失43例(28.7%)，与国内外文献报道基本一致[[url=]6[/url],[url=]12[/url],[url=]17[/url],[url=]19[/url]]，略低于部分国外报道的45%[[url=]7[/url]]。MLH1/PMS2配对缺失27例(17.3%)，MSH2/MSH6配对缺失7例(4.7%)，MSH6单独缺失6例(4%)，PMS2单独缺失3例(2%)，MLH1和MSH2均未见单独缺失。既往报道大约10%～20%子宫内膜癌中MLH1/PMS2联合表达缺失，但仅有小部分是因为胚系突变引起，大部分是由MLH1启动子甲基化造成[[url=]14[/url],[url=]20[/url]]。国外部分报道显示，子宫内膜癌中应用免疫组织化学方法检测4种错配修复蛋白表达，并与错配修复基因检测结果进行比较，蛋白表达检测的敏感性和特异性分别为91%和88%[[url=]21[/url],[url=]22[/url]]，有学者认为当MSH2或MSH6蛋白表达缺失时，即使未进行基因突变检测，也可提示Lynch综合征的存在[[url=]10[/url],[url=]14[/url]]。
错配修复蛋白表达缺失与遗传学及基因检测结果异常之间有很高的吻合度，因此推荐将错配修复蛋白检测作为初筛手段[[url=]22[/url]]。由于MLH1的启动子甲基化可造成MLH1缺失表达，因此，MLH1蛋白表达缺失病例应首先检测启动子甲基化状态，只有MLH1非启动子甲基化的病例才进一步进行MLH1基因突变检测，而MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达缺失的病例可直接进行基因突变检测[[url=]23[/url]]。MSH6罕见情况下的异质性表达常常合并MLH1和PMS2蛋白的表达缺失(68%)[[url=]18[/url]]，具有高频率微卫星不稳定(microsatellite instability-high)状态，可有MSH6移码突变。PMS2蛋白单独表达缺失病例中24%的病例无PMS2突变而存在MLH1突变，因此PMS2单独缺失表达而无相应突变时提示需要进行MLH1突变检测[[url=]24[/url]]。由此看来，在少见情况下，MSH6、PMS2蛋白表达缺失病例的基因突变情况更为复杂，并非一一对应的关系。
病理医师试图寻找有意义的病理形态特点，以助于识别和筛选Lynch相关病变[[url=]7[/url],[url=]25[/url]]。目前认为结合年龄、病理形态可以提高错配修复基因异常的检出率[[url=]7[/url]]，但有研究显示，41%的患者未表现出符合Lynch综合征筛查条件的临床病理特征(如<50岁、Lynch相关肿瘤病理形态、肿瘤位于子宫下段以及符合Betheda标准的家族史)[[url=]17[/url]]，可见是否需要结合病理形态仍需进一步证实，并且亟需临床、病理医师达成共识。有些研究认为Lynch综合征中MLH1微卫星不稳定与非子宫内膜样腺癌的内膜癌相关，但也有研究认为Lynch综合征相关子宫内膜癌的病理类型与散发病例并无不同，因此病理类型是否和Lynch综合征相关结论并不统一。我们的结果初步显示错配修复蛋白表达缺失病例的病理类型与正常表达病例差异并无统计学意义。Lynch综合征相关的子宫内膜癌病理特点中只有肿瘤内淋巴细胞浸润、肿瘤周边淋巴细胞带在错配修复蛋白表达缺失病例中明显高于表达组，而肿瘤异质性、肿瘤好发于宫体下段等特点均与错配修复蛋白表达状态不相关。进一步结合肿瘤病史及家族肿瘤遗传背景分析，具有相关肿瘤家族史的错配修复蛋白表达缺失患者(可疑Lynch综合征患者)出现肿瘤周边淋巴细胞带的几率显著高于错配修复蛋白表达患者。因此，肿瘤周边淋巴细胞带是最容易识别，也是与错配修复蛋白缺失表达最相关的病理形态特点，可作为病理医师识别的特征形态起到初筛作用。
本组结果显示错配修复蛋白表达缺失病例浸润深度通常<1/2肌层，比错配修复蛋白表达正常病例的浸润深度更浅，差异具有统计学意义，这与部分报道结果相似[[url=]19[/url]]，但也有报道错配修复蛋白表达缺失病例具有更深的肌层浸润[[url=]26[/url]]。因此，需要进一步扩大病例数量深入研究。错配修复蛋白表达缺失与子宫内膜样腺癌的分级、淋巴结转移与否、临床分期均无相关性，和部分报道相一致[[url=]19[/url]]。合并其他部位恶性肿瘤在错配修复蛋白表达缺失病例和正常表达病例之间差异也有统计学意义。本组病例中错配修复蛋白表达缺失病例有3例合并恶性肿瘤(2例卵巢透明细胞癌、1例肠癌)，且3例患者均表现多部位病灶MLH1/PMS2联合表达缺失。Jensen等[[url=]27[/url]]在子宫内膜癌合并卵巢透明细胞癌的病例中均检测到MSH2/MSH6联合表达缺失。
我们通过检测子宫内膜癌中错配修复蛋白的表达情况，初步探讨了我国子宫内膜癌患者中错配修复蛋白的表达方式和缺失率。熟悉错配修复蛋白表达缺失病例的临床病理特征，有助于进行Lynch综合征相关子宫内膜癌的筛查，但Lynch综合征的最终确认仍需进一步的分子检测。
发表于 2016-9-18 21:51:53
