葡萄糖调节蛋白78对人结直肠癌RKO细胞增殖和迁移能力的影响

阳光56

来源：《中华病理学杂志》
作者：吉秋霞，邢晓明（青岛大学附属医院病理科）刘丽丽（山东省东营市人民医院病理科）李琳（山东省禹城市人民医院病理科）

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摘要
目的：探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对人结直肠癌RKO细胞增殖和迁移能力的影响。

方法：构建编码GRP78的shRNA慢病毒表达载体pLV-shRNA GRP78及阴性对照慢病毒表达载体pLV-control，分别转染人结直肠癌细胞系RKO。四甲基偶氮唑盐法实验和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞周期的分布情况，划痕实验检测细胞迁移能力，裸鼠皮下成瘤实验检测细胞体内成瘤能力。Affymetrix人全基因组表达芯片检测GRP78表达抑制后RKO细胞中基因表达谱的变化。Western blot技术验证部分差异基因以确定结果的可靠性。

结果：转染pLV-shRNA GRP78后，RKO细胞增殖能力及克隆形成数目明显受到抑制（P<0.05），但迁移能力没有明显变化（P>0.05）；流式细胞术检测结果显示，沉默GRP78导致G1期细胞比例显著增加，而S期细胞比例显著降低（P<0.05）；裸鼠成瘤实验结果显示，沉默GRP78导致肿瘤细胞在裸鼠皮下成瘤能力显著减弱（P<0.05）。基因芯片检测结果显示，GRP78表达抑制后，共有397个基因的表达发生改变（与对照组相比，变化表达倍数≥1.2），其中上调的基因258个，下调139个，这些基因主要涉及信号转导、细胞代谢、细胞凋亡等功能。通过生物信息学分析，筛选3个（CDKN2B、MTOR及BIRC3）特异相关的差异基因进行Western blot验证，验证结果与芯片结果相符。

结论：沉默GRP78可通过抑制人结直肠癌RKO细胞周期G1/S期转换，从而抑制细胞的体内外增殖生长能力，但对细胞的迁移能力无显著影响。通过基因芯片技术能够筛选和鉴定与GRP78表达改变相关的基因。GRP78可能通过调控这些基因的表达从而影响结直肠癌细胞的增殖能力。

　　葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），又称免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），广泛存在于内质网内，是内质网应激诱导的重要分子伴侣，因与热休克蛋白具有高度同源性，而被认为是热休克蛋白家族成员之一[1]。作为内质网应激蛋白，GRP78参与新生肽链的折叠与组装以及错误折叠蛋白的修复、降解，从而维持内质网稳态，保护细胞[1,2]。由于血液供应不足及营养条件较差等原因，实体肿瘤组织内存在缺氧、酸中毒及低糖等应激的微环境，这种病理条件可以导致内质网应激并诱导GRP78的过度表达[3,4]。GRP78的高表达可能是肿瘤细胞一种自我保护机制，能够促进肿瘤细胞的恶性进展。

近年来研究表明，GRP78除了作为分子伴侣发挥作用外，还可以分泌到细胞质、细胞膜，甚至细胞外，参与多种生物学过程的调控，是一种多功能蛋白质，在肿瘤增殖、侵袭、转移及耐药性等方面发挥重要作用[5,6,7,8,9]。前期研究中我们发现，GRP78在结直肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织中的表达呈逐渐增高的趋势，提示其可能参与了结直肠癌发生[3]。但其在结直肠癌中表达改变的机制及涉及相关信号转导通路尚不明确。我们采用慢病毒转染技术沉默GRP78在结直肠癌RKO细胞中的表达，通过体内外实验研究GRP78的生物学功能，并采用基因芯片的方法，初步探讨与GRP78表达改变相关的基因，并绘制相关的信号图谱。
材料与方法
1.材料
　　人结直肠癌RKO细胞系由浙江大学医学院分子病理学实验室提供，胎牛血清及RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司，细胞转染试剂及OPTI-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，慢病毒表达载体由上海吉凯公司构建，四甲基偶氮唑盐（MTT）购于北京鼎国生物技术有限责任公司，DMSO购于上海生物试剂厂。细胞培养板购于美国Corning公司，裸鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。GeneChip primeview human基因芯片购自Affymetrix公司。GRP78抗体购自Sigma公司。CDKN2B抗体及BIRC3抗体购自Abcam公司，MTOR抗体购自Cell Signaling公司。

　　2.细胞培养、转染及稳定细胞株的构建
　　感染前1 d将RKO细胞接种至6孔板，5×104细胞/孔，使细胞达到20%汇合。去除孔内培养液，加入含病毒的完全培养液，同时加入工作液浓度为5 g/L的聚凝胺（polybrene）。次日去除含病毒的培养液，更换为完全培养液。连续培养2周后，取存活细胞稀释后转种于96孔板，用完全培养液继续维持培养，1周后取单克隆逐渐扩大培养。以pLV-control慢病毒为阴性对照。阳性克隆细胞命名pLV-shRNA GRP78，空白对照克隆细胞命名为RKO/mock。收集各组细胞提取蛋白质，采用Western blot的方法检测各细胞系中GRP78蛋白的表达情况。

　　3.MTT实验
　　选取对数期生长的各组人结直肠癌RKO细胞，0.25%胰酶消化，以2 000个细胞/孔接种到96孔培养板中，37 ℃，5% CO2培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后去除培养液，每孔加入20 μL MTT（5.0 g/L），继续培养4 h后完全吸弃板中的培养液，每孔加入150 μL的DMSO，震荡5～10 min，490 nm处测定各孔吸光度（A）值。连续测定5 d。重复3次。

　　4.克隆形成实验
　　选取对数期生长的各组人结直肠癌RKO细胞，0.25%胰酶消化，400个细胞/孔接种到6孔板，于培养板中继续培养到2周，2周后吸除培养液，PBS洗涤后每孔加入多聚甲醛1 mL固定30 min，除去多聚甲醛，每孔加入Giemsa染液500 μL染色20 min，吸除染液，用PBS反复洗涤至洗脱液无色。6孔板扫描。重复3次。

　　5.细胞周期实验检测
　　将各组人结直肠癌RKO细胞接种到6孔板，待细胞生长至覆盖率约为80%，吸弃细胞培养上清，D-hanks洗涤细胞一次，0.25%胰酶消化，收集细胞于5 mL离心管中，1 200 r/min离心5 min，用预冷的PBS洗涤1次，缓慢滴入预冷的70%乙醇1 mL，4 ℃固定过夜；1 000 r/min离心，收集沉淀细胞，PBS洗涤2次，加入500 μL PI染液，37 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

　　6.划痕实验
　　取对数生长期的各组人结直肠癌RKO细胞，0.25%胰酶消化，按4×105个细胞/孔种于24孔板，细胞呈现单层贴壁生长状态且汇合度达到100%，用10 μL移液器头给培养皿中的细胞划痕，以不含胎牛血清的RPMI 1640培养液漂洗刮下的飘浮细胞。用不含胎牛血清的RPMI 1640培养液，在5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养24 h。划痕后0、8、24 h给细胞拍照，观察划痕愈合能力。重复3次。

　　7.裸鼠皮下成瘤实验
　　选取对数生长期的转染pLV-shRNA GRP78及pLV-control的人结直肠癌RKO细胞消化并制成细胞悬液，按照1×106个细胞/mL的浓度注射于5周龄的BALB/c裸鼠肋腹侧，标记裸鼠；从皮下注射后第15天起每2天观察裸鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤体积（V＝π/6×A×B2）并记录肿瘤生长曲线；23 d后处死裸鼠，测量肿瘤终体积、称重并拍照。

　　8.芯片检测及生物信息学分析（由上海吉凯公司完成）
　　选取对数生长期转染pLV-shRNA GRP78及pLV-control的人结直肠癌RKO细胞，Trizol法抽提总RNA，经质检后采用GeneChip 3'IVT Express试剂盒制备带有生物素标记的aRNA，纯化及片段化后进行芯片杂交。芯片结果采用GeneChip Scanner 3000进行扫描，Expression Console Version 1.1读取原始数据，质控合格的数据采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理；MAS3.0软件做分子功能分析。转染pLV-shRNA GRP78及pLV-control的人结直肠癌RKO细胞分别进行3次生物学重复。筛选差异倍数在1.2倍以上的基因，对差异基因进行GO分类及Pathway的初步分析，并绘制基因关系网络图。收集各组细胞并提取蛋白质，采用Western blot的方法检测各细胞系中MTOR、BIRC3、CDKN2B蛋白的表达情况。

　　9.统计学分析
　　所有数据均为至少3次重复实验的计算结果。结果用均值±标准差（±s）表示；两组数据比较采用独立样本t检验。使用SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。
结果
1.沉默GRP78可显着抑制人结直肠癌RKO细胞的增殖和克隆形成能力
　　人结直肠癌RKO细胞转染慢病毒表达载体pLV-shRNA GRP78后，与阴性对照组相比，GRP78蛋白表达水平明显降低（图1）。MTT实验发现，沉默GRP78后，肿瘤细胞增殖速度比对照组明显减慢（P<0.05，图2）。克隆形成实验显示，沉默GRP78后，RKO细胞不仅形成的克隆数目显着减少，而且形成的克隆也明显变小（P<0.05；图3A，图3B）。

　　2.沉默GRP78可显着抑制人结直肠癌RKO细胞周期的G1/S期转换
　　流式细胞术检测发现，沉默GRP78后RKO细胞G1期比例（60.22±0.81）%，S期比例（30.06±0.38）%，G2/M期比例（9.72±1.06）%；阴性对照组RKO细胞G1期比例（51.58±0.40）%，S期比例（40.73±0.42）%，G2/M期比例（7.69±0.77）%；空白对照组RKO细胞G1期比例（57.45±1.39）%，S期比例（36.56±2.18）%，G2/M期比例（5.99±0.96）%。与阴性对照组相比，沉默GRP78后RKO细胞的G1期细胞群体明显增多，而S期细胞群体减少；G1期细胞比率增加8.64%，S期细胞比率减少10.67%（P<0.05，图4）。

　　3.沉默GRP78对人结直肠癌RKO细胞迁移能力无显着影响
　　划痕实验结果显示，与阴性对照组相比，GRP78表达抑制对划痕所产生的无细胞区域间距无显着影响（P>0.05，图5）。

　　4.沉默GRP78可显着抑制人结直肠癌RKO细胞在裸鼠体内的成瘤能力
　　23 d后处死裸鼠，切除肿瘤，测量终体积、称重。实验发现，与对照组相比，沉默GRP78后肿瘤细胞在裸鼠皮下成瘤的体积及质量显着减小，二者差异有统计学意义（P<0.05，图6）。

　　5.差异表达基因的生物信息学分析
　　（1）差异基因的注释和功能分析：差异在1.2倍以上的基因共有397个，与对照组RKO细胞相比，GRP78抑制的细胞中表达上调的基因有258个，表达下调的基因有139个。通过GO分类和pathway的初步分析，提示这些基因主要参与细胞代谢、凋亡、细胞周期及免疫应答等生物学过程，并与多个肿瘤相关信号通路密切相关（表1）。

（2）共表达网络的构建：应用Genenmania软件对筛选出的差异基因进行共表达网络构建，发现MTOR、BIRC3、CDKN2B基因在网络中有共表达趋势，涉及PI3K/AKT/MTOR及凋亡相关信号通路。

（3）Western blot验证：在蛋白水平上对3条目的基因MTOR、BIRC3及CDKN2B分别进行Western blot验证，结果显示3条基因表达趋势与基因芯片结果一致（图7），提示芯片检测结果可靠。










讨论
结直肠癌（colorectal cancer）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。2012年全球流行病学调查结果显示，结直肠癌的发病率及病死率分别位居恶性肿瘤第3位及第4位[10]。因此积极开展结直肠癌的分子生物学研究，对于结直肠癌的防治有很大的现实意义。利用蛋白质组学的方法，我们发现GRP78在结直肠癌中高表达，并且表达升高与淋巴结转移及远处转移无关[3,11]。

　　GRP78是热休克蛋白70家族的成员之一，存在于多种组织细胞的内质网膜中。在低糖、缺氧及化学毒物等应激条件下，GRP78的合成明显升高[1,2]。GRP78表达升高有助于促进错误与未折叠蛋白恢复正常构像、维持细胞内Ca2＋平衡、对抗氧化应激，从而减轻内质网应激、保护细胞[5,6,7,8]。近年来的研究表明，GRP78是一种多功能蛋白质，在恶性肿瘤细胞中，GRP78从细胞质转运到细胞膜，通过与巨球蛋白α2结合，激活多种信号转导通路，包括MAPK、NF-κB及表皮生长因子受体（EGFR）等促进肿瘤细胞的增殖、浸润及转移[12,13]。我们研究发现，当GRP78表达抑制后，RKO细胞增殖能力减弱，G1期细胞数量增多。裸鼠体内实验结果显示，抑制GRP78的表达导致裸鼠体内成瘤能力减弱。这些结果表明GRP78通过调节细胞周期及凋亡来影响细胞的增殖能力。然而我们没有发现GRP78表达改变与RKO细胞迁移能力之间的相关性，前期组织学实验也证实GRP78的表达升高与淋巴结及远处转移无关[11]。与我们的研究结果不同，大量研究数据表明，GRP78参与不同肿瘤细胞迁移的过程。Wu等[14]发现GRP78表达下调可以抑制前列腺癌细胞的迁移。苏荣建等[15]应用小干扰技术特异性下调GRP78表达可以抑制肝细胞癌的转移。Li等[16]研究显示，在结直肠癌DLD1细胞中，GRP78过表达可增加uPA、基质金属蛋白酶2的分泌，从而促进结直肠癌细胞的转移。我们推测产生这种差异的原因可能是由于癌细胞的异质性，不同的癌细胞在应对应激时激活的信号转导通路不同。为进一步明确与GRP78表达改变相关的信号转导通路，我们采用基因芯片的方法差异分析与GRP78表达相关的基因，以期寻找相关信号通路，为今后的研究奠定基础。

　　芯片分析结果显示，GRP78抑制导致RKO细胞中397个基因表达发生改变，这些基因参与细胞代谢、凋亡、细胞周期及免疫应答等生物学过程，并与多个肿瘤相关信号通路密切相关。共表达网络构建结果发现，抑制GRP78表达后，RKO细胞中MTOR、BIRC3及CDKN2B呈高表达。MTOR属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于各种生物细胞内，在细胞增殖、分化和血管形成中起重要作用，与多种肿瘤的发生密切相关[17,18,19,20]。另外，MTOR是PI3K/AKT信号通路的重要组成部分，PI3K/AKT信号通路为细胞内重要的信号转导通路之一，通过诱导肿瘤细胞的增殖、侵袭及拮抗化疗而促进肿瘤的发生、发展及耐药[21]。BIRC3作为一种凋亡相关基因，参与多种肿瘤的发生，与肿瘤抗药性及预后差等相关[22]。Yang等[23]发现，BIRC3通过竞争性抑制Smac/DIABLO诱导肿瘤细胞的增殖。CDKN2B/P15被称为细胞周期依赖性激酶抑制基因（cyclin dependent kinase inhibitor 2B），是一种潜在抑癌基因，通过阻止细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）和细胞周期蛋白D相互结合，特异性抑制CDK6、CDK4的活性，阻止Rb蛋白的磷酸化，不能释放E2F，抑制DNA的转录，进而限制细胞从G1期进入S期，阻止肿瘤的发生。尽管以往的研究表明该3个基因的表达改变与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，但他们在结直肠癌中表达是否有改变，与GRP78的相互作用如何，通过哪条信号转导通路与GRP78之间构成调控与被调控的关系，这些均少见相关报道。有待我们进一步的研究分析。

　　总之，我们的实验研究结果表明，GRP78表达下调可以抑制结直肠癌RKO细胞的增殖；利用基因芯片结合生物信息学分析技术，能够筛选和鉴定与GRP78表达改变相关的基因并构建共表达网络。GRP78可能通过调控这些基因的表达进而影响结直肠癌增殖能力，这有助于进一步理解GRP78在结直肠癌中表达改变的作用及相关机制。