靶向测序技术检测早期NSCLC患者的ctDNA

阳光56

外周血中分离的ctDNA已被用于原发肿瘤的基因突变检测，然而，之前的报道多是集中于晚期肿瘤，少有用于早期肿瘤ctDNA检测的。本研究中，收集了58位早期NSCLC患者（IA、IB、IIA期）配对的血液和组织标本，采用靶向测序技术检测配对的肿瘤DNA（tDNA）和血浆ctDNA。结果在EGFR、KRAS、PIK3CA和TP53基因中检测到体细胞高频突变，以及其他低频突变的基因，整体一致性为50.4%、敏感性为53.8%、特异性为47.3%。细胞游离DNA（cfDNA）浓度与临床特征包括肿瘤分期和亚型存在显著的关联性。重要的是，cfDNA比现在常用的蛋白肿瘤生物标记物具有更高的阳性预测值。本研究证实了采用靶向测序技术检测早期肺癌患者血浆ctDNA突变的可行性，以及ctDNA靶向测序技术用于NSCLC患者临床管理的潜力。

前言
肺癌是全球最常见的肿瘤，且是癌症死亡的主要原因，2012年死亡人数接近160万。癌症的早期确诊并及时治疗能够实现最高效的管理可使患者达到最大的生存机会。然而，仅有30%肺癌患者在早期被诊断。IA期NSCLC患者的5年生存率提高到了73%，而IIIA期患者的5年生存率仅有24%。
早期诊断是对抗癌症的关键，但对一些肺癌患者来说仍是挑战。例如，由于肿瘤位置特殊使得活检取材困难而无法获得组织标本，影像学诊断很难区分良恶性病灶，这些对于小病灶来说尤其困难。尽管血液中肿瘤标志物如CEA、CA19-9、CA125、CYFRA21-1以及NSE的检测有助于癌症诊断，但这些标志物并非是肺癌特异性的，它们可能与其他病理相关。因此越来越多的微创诊断技术正在不断研究中。
近期研究显示，肿瘤细胞裂解或凋亡后会向血液中释放DNA，称为循环肿瘤DNA（ctDNA），ctDNA可被分离并有助于癌症治疗。即使含有500万个细胞的小肿瘤也可以释放出足够检测的DNA，而经过标准化疗后的相同大小的肿瘤细胞ctDNA可能低于检测限度。ctDNA是血液循环DNA（cfDNA）的一小部分，突变DNA比例只占全部测定DNA的0.02%-0.1%，因此需要高敏感的技术应用于ctDNA的突变检测。
以前的研究多是检测晚期肺癌患者ctDNA的基因突变状态，且是分析有限数量的基因，尤其是EGFR和KARS这些肺癌中高频突变的且有靶向治疗药物的基因。下一代测序Ion PGM技术能够同时筛选多个基因突变，可有效判断临床肺癌患者血浆ctDNA的临床特征。因此，本前瞻性研究的目的是评价Ion PGM和AmpliSeq Cancer panel结合的靶向DNA测序技术应用于检测58位早期NSCLC患者配对血浆ctDNA和肿瘤DNA（tDNA）的癌症相关50个基因突变状态的可行性。

结果
配对tDNA与ctDNA的一致性
表1汇总了58位肺癌患者的临床特征，分析了配对的58对tDNA和ctDNA标本基因突变状态，结果显示，在tDNA和/或ctDNA中检测的50个基因中，45个基因发生突变，突变率77.6%，每对标本平均有2.24个突变。
27对配对tDNA和ctDNA均为突变阳性标本，突变一致率为50.4%，敏感性为53.8%（95% CI：35.3%-71.5%），特异性为47.3%（95% CI：28.6%-66.8%），血浆阳性预测值（PPV）为53.2%（95% CI：34.8%-70.8%）。除了tDNA和血浆ctDNA外，患者的白细胞（WBC）DNA也用于检测，均未发现任何体细胞突变，说明对不同突变体测序读长的低背景检测的可靠性。图1显示了45对标本的突变结果及对应的患者临床特征，以及13对未突变患者及对应的临床特征。
图1  配对tDNA和血浆ctDNA的基因突变结果及患者特征汇总
标本分类：1）AJCC分期（IA、IB、IIA）；2）病理诊断；3）性别；4）年龄段：5）吸烟史；6）GGO；以及肿瘤大小（顶部）。每对标本tDNA（中间）和血浆ctDNA（底部）突变状态（SNP、MNP、Indel）。未突变标本标记在右上方

血浆ctDNA和tDNA标本突变状态
图2A中显示了tDNA和ctDNA配对标本15个基因的突变状态。图2B中显示了 58对标本中，最常见的突变类型是SNPs（tDNA和ctDNA标本突变率分别是78.9%和81.7%）；DNA标本Indels突变率19.3%，ctDNA标本Indels突变率15.5%；MNPs突变率分别是tDNA 1.8%、ctDNA 2.8%。
图2  58对tDNA和ctDNA样本驱动基因突变比例和分布
（A）配对tDNA和ctDNA标本突变率；（B）饼图显示配对tDNA（左）和ctDNA（右）标本的突变类型分布。内环显示癌症类型（AC、SCC）分布，外环显示每种癌症类型的突变（SNP、Indel）频率

临床特征与cfDNA浓度
表2中汇总了NSCLC患者一系列的临床病理参数，包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤组织学、分期、分化程度、GGO、血管侵润和VPI以及cfDNA浓度。分析显示cfDNA浓度与临床病理参数间无任何相关性。

表2  cfDNA浓度与临床特征相关性
cfDNA与血清肿瘤标志物检测
检测血浆标本中肿瘤生物标志物CA125、CA19-9、CEA、CYFRA21-1及NSE。共在25例血浆标本中检测到以上5种标志物阳性，阳性率53.1%。对应检测到cfDNA突变阳性52例，阳性率89.7%。结果显示，对于早期NSCLC患者，cfDNA相较于5种血清肿瘤生物标志物具有更高的PPV。

讨论
本研究前瞻性的使用Ion PGM和AmpliSeq Cancer Panel结合的靶向测序技术检测早期NSCLS患者血浆ctDNA突变，且是第一例前瞻性研究。52位患者（89.7%）均检测到可量化的cfDNA，表明cfDNA可作为判断肿瘤的预测因子。在58位患者样本中检测到35例（60.3%）ctDNA突变和tDNA突变，一致率为50.4%、敏感性53.8%、特异性47.3%，PPV为53.2%。结果显示，ctDNA靶向测序在临床NSCLC患者管理上具有潜在价值。
总而言之，本研究证实了Ion PGM和AmpliSeq Cancer Panel结合的靶向测序技术涵盖大量已知的肿瘤驱动突变基因，用于早期NSCLC患者血浆检测ctDNA突变状态，与组织标本具有较高的一致性，且比不同肿瘤标志物具有更高的检测敏感性。研究发现，cfDNA浓度与肿瘤分期及肿瘤进展相关，因此该测序技术容易在临床应用，并为早期NSCLC患者提供标准的诊断和预后评估。