Fish技术在非小细胞肺癌中的应用

阳光56

肺是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率亦居癌症的首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的85%以上，而且大部分就诊时已属进展期。

　　近年来在NSCLC的治疗上，化疗的地位虽然没有发生根本动摇，但其疗效已达到一个平台，毒性和不良反应也限制了临床应用。随着生物技术在医学领域的快速发展和从细胞分子水平对发病机制的深入认识，肿瘤生物治疗已进入了一个全新的时代。分子靶向治疗，指的是针对肿瘤细胞里面某一个蛋白家族的某部分分子，或者是一个核苷酸的片段，或者一个基因产物进行治疗。分子靶向治疗是目前肿瘤治疗的一个“闪光点”，凭着它的特异性和有效性，已取得很大成功，是目前国内外治疗的“热点”。

　　研究表明，50% NSCLC的发生是由于一系列的驱动基因，包括EGFR、KRAS、ALK、Akt、MEK、PI3K、BRAF等，其中最常见的为EGFR和KRAS突变。肺腺癌作为占据NSCLC总数50%以上的大户，是最常见的组织亚型。肺腺癌可以根据相关驱动基因突变进一步细分成更多的亚群（图1）。截止目前，这些驱动基因包括EGFR、KRAS、HER2、PIK3CA、BRAF基因突变、MET基因扩增和ALK、ROS1、RET基因重排。

　　鳞状细胞癌在NSCLC中排名第二，大约占20-30%。鳞状细胞癌中，EGFR基因突变非常罕见，只有成纤维细胞生长因子受体-1（FGFR1）的基因扩增，盘状结构域受体2（DDR2）基因突变和PI3KCA基因的扩增和突变比较常见（图1）。针对上述变异的靶向治疗药物在临床上也确实非常有效。
图1：非小细胞肺癌遗传变异的简要情况
图1：非小细胞肺癌遗传变异的简要情况
（引自《晚期非小细胞肺癌的靶向治疗（综述）》，丁香园，作者张波，2015-03-05）
　　其中指南推荐检测ALK、ROS1、RET基因重排和MET基因扩增靶向治疗的方法为荧光原位杂交（FISH）技术。

一、 EML4-ALK基因重排

　　ALK基因最初是在间变性T细胞淋巴瘤和炎性成纤维细胞瘤中发现。目前已发现其参与形成的融合基因（X-ALK）与多种肿瘤的发生密切相关。2007年Soda等首次发现EML4-ALK融合基因存在于部分NSCLC中。

　　EML4与ALK定位于2号染色体短臂上，但两者方向相反，相隔12 Mb，融合时须EML4或ALK其中之一反向与对方连接，EML4-ALK基因亚型取决于两者断裂相接的位置，因此EML4断裂点呈现出多变性，目前已检测到的断裂点有2、6、13、14、15、17、18、20号外显子，这些形成了至少11种EML4-ALK融合基因亚型，已有实验证实它们中的大部分能促进肿瘤生成。
EML4-ALK基因重排
　　EML4-ALK融合基因有望成为继表皮生长因子受体（EGFR）后另一种有明确疗效预测作用的分子标志物，它被证实是NSCLC发生发展过程中独立而又关键的分子靶点，在NSCLC中的发生率约为5%。

　　克唑替尼是一种ATP竞争性酪氨酸激酶小分子抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。

　　临床试验显示对于ALK阳性的进展期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显着优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位无进展生存期(PFS)为7.7个月，有效率达到65.3% 。

　　基于其良好的疗效和耐受性，2011年美国药品食品管理局（FDA）批准克唑替尼用于治疗ALK阳性的进展期非小细胞肺癌。

　　2012年克唑替尼获得欧盟批准，用于进展期非小细胞肺癌。

　　2013年初，中国食品和药品监督管理总局（CFDA）批准克唑替尼（赛可瑞）用于治疗ALK融合阳性的局部进展期或转移性NSCLC患者。

　　色瑞替尼是第二代的ALK抑制剂，可用于初治的或克唑替尼治疗失败的ALK阳性肿瘤。2014年，FDA批准色瑞替尼用于ALK阳性的转移性非小细胞肺癌和克唑替尼治疗失败的非小细胞肺癌患者。

二、 ROS1基因断裂

　　ROS1 全称c-ros原癌基因，是一种跨膜的受体酪氨酸激酶基因。在成人的肾脏、小脑、外周神经组织、胃、小肠和结肠中ROS1蛋白表现为高表达状态，而在其它组织中表现为低表达。 但在正常的人肺组织中，到目前为止还没有发现ROS1蛋白表达。研究显示，ROS1染色体的重排可以激活ROS1激酶活性。

　　约有 1-2％的 NSCLC 患者携带重组基因，这些基因与编码 ROS1 原癌基因受体酪氨酸激酶（ROS1）基因相关。染色体重排导致 ROS1 与多种不同结合体发生融合，产生有持续活性的激酶，从而激活 MAP 激酶、STAT3、和磷酸酰肌醇 3- 激酶（PI3K）通路。除肺癌外，在恶性胶质瘤、胆管癌、胃癌等肿瘤中也发现了这种重排。ROS1 重排更多见于 NSCLC 年轻患者，腺癌无吸烟史的患者。

　　随着对ROS1研究的深入和克唑替尼的研发成功，已经改变了肺癌的诊疗现状。尤其是克唑替尼在进展期ROS1阳性非小细胞肺癌中疗效显着，为肺癌治疗带来了新选择。

　　ROS1基因重排可导致癌基因ROS1融合激酶的表达，并增强对ROS激酶抑制剂的敏感性。ROS分型可作为接受crizotinib治疗高度受益NSCLC亚组人群的筛选策略，缓解率高达57%。

　　FDA药物评价和研究中心主任、肿瘤产品办公室主任Richard Pazdur表示，克唑替尼和配套诊断方法的批准使得临床可以选择更有可能对该药物应答的患者。对于靶向治疗来说，克唑替尼是治疗这种疾病的重要选择。

　　2013年最新版NCCN已推荐ROS1检测，用于克唑替尼适用患者筛选。

　　2015年，FDA授予抗癌药Xalkori（crizotinib，克唑替尼）突破性药物资格，用于ROS1阳性NSCLC的潜在治疗。

　　对于一些EGFR突变阴性的进展期NSCLC患者，在化疗耐药或耐受不了化疗时，可根据ALK或ROS1融合基因的结果选择Crizotinib药物治疗。

三、RET基因融合

　　RET原癌基因定位于10号染色体长臂（10q11.2），由RET原癌基因编码的RET蛋白是一种受体酪氨酸激酶，受体与配体结合后胞内区的TK磷酸化，激活下游信号转导通路，调节细胞生存并诱导细胞增生。RET基因突变在多方面增强了RET TK信号转导的功能，进一步促进激酶的活化和原癌基因的转化。RET原癌基因能与多种基因发生融合，常以本身断裂再与另一基因接合的方式重组成一个新的基因，从而逃脱受体结合配体的调控，进行自我磷酸化、自动传导信号，引发肿瘤生成。

　　RET基因与人类癌症之间的首次联系是基于甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)中RET基因体细胞重排的发现。这些重排序列导致了酪氨酸激酶的组成性激活。RET基因重排可存在于30%散发的和70%辐射诱导的乳头状甲状腺癌中。迄今已发现12个不同的RET基因5’端融合配体基因。RET的生殖细胞活化点突变与多发性内分泌腺瘤病2型(multiple endocrine neoplasia 2，MEN 2)综合征相关。MEN 2 综合征分为3个不同的表型：MEN 2A[甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PC)和甲状旁腺功能亢进症]、MEN 2B(MTC和PC)和家族性甲状腺髓样癌(FMTC)。每个表型都与RET基因特定的突变位点相关。RET基因体细胞突变也与50%的散发性甲状腺髓样癌相关。

　　2012年4个独立的研究小组发现在NSCLC中存在一种与RET激酶结构域相关的新的重排突变。这些研究组共筛查了2 650个肺癌患者，显示RET突变的频率为1%。RET在正常肺组织中的表达非常低，当有RET融合基因存在的情况下表达量明显增高。融合基因可以用RT-PCR，荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)和免疫组织化学的方法来测定。FISH虽然耗费成本与人力，但仍然是检测NSCLC RET融合基因的金标准。

　　RET基因可以与CCDC6，KIF5B，NCOA4和TRIM33等易位融合。虽然RET融合蛋白在肺腺癌的功能尚不完全清楚，在体外和体内实验发现，RET基因融合具有致癌活性。在体外研究中发现，RET基因融合产物对多靶点激酶抑制剂较敏感，如凡德他尼（vandetanib）、索拉非尼（sorafenib）和舒尼替尼（sunitinib）。在一项关于RET的前瞻性研究中，发现三例RET融合阳性的患者对多靶点激酶抑制剂卡博替尼（cabozantinib）的冶疗表现出部分缓解或病情控制。在KIF5B-RET基因融合阳性的Ba/F3细胞模型中，多靶点激酶抑制剂凡德他尼（vandetanib）对细胞增殖具有抑制作用。另外，还发现一位KIF5B-RET 融合阳性的肺腺癌患者在使用凡德他尼治疗后病情得到缓解。

　　Cabozantinib是一种口服药物，通过靶向抑制MET、VEGFR2 及RET信号通路而发挥抗肿瘤作用，它能够杀死肿瘤细胞，减少转移并抑制血管生成。

　　2012年11月29日，Exelixis公司宣布，药物cabozantinib已获FDA批准用于不可手术切除的恶性局部进展期或转移性甲状腺髓样癌(MTC)的治疗。

　　2015年，卡博替尼被NCCN指南推荐用于RET重排的非小细胞肺癌患者。RET重排在所有NSCLC中的发生率为1%-2%，在排除了EGFR突变、K-ras突变和ALK重排的人群中，RET重排发生率就会明显升高。

四、MET基因扩增

　　原癌基因c-MET位于人类7号染色体长臂（7q31），编码的间质表皮转化因子（MET）广泛表达于肺、肝、肾、胎盘、消化道等多种人类上皮组织，属Ⅱ型酪氨酸激酶受体。MET与其配体HGF（hepatocyte growth factor， 肝细胞生长因子）结合，引起受体酪氨酸磷酸化并通过PI3K和AKT、STAT3或者RAS和MAPK激活下游信号通路。在人类实体瘤和血液恶性肿瘤中，包括胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌，这条信号通路是最常发生异常的信号通路之一。

　　临床前数据显示，MET基因扩增肺癌细胞株依赖MET分子信号转导通路生长和存活。

　　MET酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼（crizotinib，PF-02341066）对c-MET扩增的胃癌细胞具有抗肿瘤作用，另一种MET TKI（PHA-665752）对MET扩增型肿瘤相当敏感。克唑替尼抑制MET扩增的NSCLC细胞MET信号通路，引起细胞凋亡，并伴随AKT和MAPK下游通路的ERK磷酸化减弱，但非激酶区域突变（外显子14的N375S或缺失突变）阳性的NSCLC细胞不出现这种现象，这些结果推测MET信号通路对维持MET基因扩增的NSCLC细胞生存是必需的，但对没有扩增和MET非激酶区域突变的细胞则不然，尽管MET-TKIs对MET激酶区域突变有作用。

　　卡博替尼（Cabozantinib）是一种口服药物，通过靶向抑制MET、VEGFR2 及RET信号通路而发挥抗肿瘤作用，它能够杀死肿瘤细胞，减少转移并抑制血管生成。

　　MET基因的过表达和扩增见于很多肿瘤组织细胞中，MET基因扩增与临床预后差相关。

　　MET基因被认为与肺癌预后有潜在的关系，FISH检测MET基因位点扩增阳性，预示生存期短；MET基因的过表达和扩增可导致酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如易瑞沙等对肺癌治疗产生耐药性。

　　MET扩增有望作为NSCLC等恶性肿瘤的驱动基因，从而实现HGF/C-MET信号通路的精准治疗，有前景的药物包括克唑替尼、卡博替尼和AMG-337等口服C-MET抑制剂。

小结：

　　虽然有文献报道可以用免疫组化及PCR法等方法检测上述四种融合基因，但均未达到理想结果。因此，目前来说，FISH仍是金标准。当然此方法也存在缺点，一方面需要荧光显微镜观察，而且荧光长时间照射很容易消失，另一方面此方法价格较高。但任何一种技术都不是绝对完美的，FISH也一样。不过FISH技术由于其高灵敏度和特异性、操作简便快速、可以直接在细胞水平（细胞核）上观察到DNA扩增的直接证据，而且细胞核上所显示出的扩增DNA荧光信号数量多少与扩增水平相关等技术优势，在临床应用中发挥着不可替代的作用。