个体化治疗时代的结直肠癌病理诊断

晓晓

　　本文转自《中华病理学杂志》Chinese Journal ofPathology--2014年，43卷(2期)
　　作者：来茂德
　　肿瘤治疗从同病标准化同治走向同病个体化异治，进入了个体化治疗的时代。个体化治疗需要个体化诊断，这对病理诊断提出了新的要求，但对病理学科来讲更是一个发展机遇。
　　从肿瘤病理诊断的发展过程，可以预测未来20年病理诊断的发展趋势。从19世纪中叶Virchow创立现代病理学，诊断主要依据病变的大体改变，部分结合组织学改变。至20世纪初主要依据组织学改变来进行肿瘤的病理学诊断。20世纪70年代第1版WHO肿瘤组织病理学分类蓝皮书依据的是显微镜下的组织病理学改变。以后免疫组织化学方法进入病理，用于肿瘤病理的诊断和鉴别诊断。21世纪初，新版的WHO分类已有极大的拓展，组织病理学改变结合免疫组织化学标记和分子遗传学改变来进行比较精确的分类和分型。相信随着全基因组测序技术以及其他分子生物学技术的应用，基于以分子改变为核心的肿瘤病理分类、分型的诊断将会出现，到那时，病理学的诊断将面临分化。伴随肿瘤病理诊断的进化，病理诊断的任务也有相应的改变。从早先的区别良恶性，到后来的外加肿瘤组织学类型、分级和分期，到现在结合靶标检测，可以提示疾病预后和预测治疗的反应。近年来，肺癌靶向诊断和靶向治疗快速发展告诉我们，一味细分形态学类型的意义已经不是很大。病理组织学类型和诊断性标志物存在的价值就是对临床诊断和治疗有帮助，否则就会被淘汰。以前，诊断肺癌时我们要区分鳞癌、腺癌、神经内分泌肿瘤等组织学类型，腺癌还细分不同的亚类(型)。现在明确腺癌后，进一步的工作更重要的不再是细分组织学亚类，而是分子检测。从这一发展角度看，组织学分类诊断被分子学诊断替代的萌芽已经出现。
　　近二十年来，结直肠癌(colorectal cancer)的分子机制研究一直走在实体瘤研究的前沿，但研究成果转化应用不是很多，被快速发展的肺腺癌靶向诊断和治疗抛在了后面。现阶段，满足患者治疗要求的结直肠癌病理诊断，首先是常规的组织病理学诊断，在组织学诊断的基础上进行分子靶向检测和特异位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测。一是为化疗药物的选择提供参考的微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)检测和特定位点的SNP检测；二是为实施靶向治疗提供依据的KRAS、BRAF突变检测；三是提示预后意义的分子标志物检测(目前还未有公认的标志物)。
　　一、组织病理学分类
　　迄今肿瘤的组织病理学诊断还是基础，依据镜下形态的差异可以将其分为不同类型。不同形态学类型存在的价值在于对治疗的选择和预后判断有指导意义。2010版WHO消化系统肿瘤分类将结直肠癌分类为腺癌、腺鳞癌、梭形细胞癌、鳞状细胞癌和未分化癌。腺癌又分为6个组织学亚类，即筛状粉刺型腺癌、锯齿状腺癌、髓样癌、微乳头癌、黏液腺癌和印戒细胞癌。在这6个亚类中，黏液腺癌和印戒细胞癌是经典的类型，一般认为印戒细胞癌预后差，黏液腺癌的预后较普通腺癌差，但也有大样本研究证实，黏液腺癌如果实施根治性治疗，其预后与普通腺癌没有差别。因此，虽然这两个亚类在所有结直肠癌中所占的比例不大，但临床仍需认真手术，合理治疗以取得好的生存和预后。黏液腺癌也有两类，一类是发生于遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)患者，这类患者常见高频微卫星不稳定性(microsatelliteinstability-high frequence，MSI-H)，预后好。而另一类是低频微卫星不稳定性(microsatellite instability-low frequence，MSI-L)／微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)，预后则相对较差。结直肠癌真正的印戒细胞癌很少，不到结直肠癌的1％，但有小部分印戒细胞癌为MSI-H，这部分患者预后相对较好。髓样癌形态特别，诊断不难，但发生率很低，病理科医师很少能遇到。一般在分子水平上为MSI-H。微乳头腺癌淋巴结转移率高，预后差。
　　锯齿状腺癌是一个新的病理类型，以其形态学特征命名。腺体呈锯齿状，常有黏液分化但没有黏液腺癌这样大量的黏液，细胞质呈嗜酸性，核呈空泡状。分子水平上常有BRAF突变和CpG岛的甲基化。锯齿状腺癌大多来自锯齿状腺瘤的恶变，预后较传统腺癌差。远端结肠锯齿状腺癌的预后比近端结肠的更差。近端结肠锯齿状腺癌5年累积生存率超过70％，而远端结肠锯齿状腺癌的5年生存率小于30％。
　　筛状粉刺癌在组织病理学上类似乳腺癌的粉刺状癌，筛状腺体中央大小不一的坏死组织，分子水平上常为MSS，预后较MSI-H型结直肠癌差。
　　在实际病理诊断中，绝大多数结直肠癌是混合类型的，也就是说多取材之后，一个患者的标本中这些组织学类型多少都能被看到，临床病理诊断则以主要的组织学类型为依据。除外这些类型，还有一部分不能归入这6个类型中的腺癌应该是以前版本中的管状腺癌。2010版WHO分类没有将这一组织学亚型列入其中，给诊断带来了困难。
　　有关结直肠癌的分级近年来变化不大，大多依据腺管的比例定级。如果腺管占总癌组织的95％以上，称为高分化腺癌，腺管少于50％为低分化腺癌，50％-95％的为中分化腺癌。根据一般经验，70％的患者为中分化腺癌，高分化和低分化腺癌分别占10％和20％。这种三级分类有时会造成不同病理医师或同一病理医师不同时间看片会有较大的出入，高分化与中分化、中分化与低分化之间的取舍有争议。为了减少这种不一致现象，以便文献的比较，近年来建议使用二级分类法，即以50％为界，高中分化归入低级别，低分化及未分化则归入高级别。在组织形态学分化差的肿瘤依据MSI检测结果，分别将MSI-H归入低级别，而MSI-L／MSS归入高级别，如MSI-H黏液腺癌、印戒细胞癌和髓样癌归入低级别结直肠癌，而同样形态的MSI-L／MSS肿瘤则归入高级别。总体上，低级别80％强，高级别20％弱。TNM分期也有了一些新变化，限于篇幅这里不再赘述，有兴趣的读者可参阅作者已发表的文章。
　　二、MSI与治疗和预后
　　MSI检测有提示预后和指导用药的意义。早先认为MSI-H病例，对5氟尿嘧啶(5-Fu)的治疗较MSI-L／MSS患者有更好的反应。近年来大样本报告和Meta分析都提示MSI-H患者预后更好，但MSI-H患者不能从5-Fu单药的辅助治疗中获益。尽管对其争议还未消除，但消化科专家达成共识的是MSI-H患者至少不能单独使用5-FU，必须多药联用。因此，如果临床上考虑使用氟尿嘧啶类的药物治疗，必须先检测MSI状态。
　　MSI指微卫星位点长度发生改变而在电泳上呈现迁移率改变的一种现象，是由错配修复基因缺陷所引起的。美国国立癌症研究所(NCI)推荐检测5个微卫星位点的标准方法(Bethesda protocol)，即Bat26、Bat25、D2s123、D5s346和D17s250。这5个位点中有2个以上存在不稳定性定义为MSI-H，如仅1个位点不稳定，则定义为MSI-L，没有位点不稳定定义为MSS。假如检测很多微卫星位点，则以30％为界：≥30％位点有不稳定性定义为MSI-H，<30％则为MSI-L。理论上讲，只要检测位点足够多，就会发现MSI的存在。考虑到费用和简便，有学者报道Bat25和Bat26检测有足够的特异性和敏感性，两者之一阳性就可以确定为MSI-H。我们实验室的经验，Bat26单独检测可以特异性地判断MSI-H。另有报道D2s123单个位点检测也有很好的特异性。有实验室用错配修复蛋白免疫组织化学来初筛微卫星状态。一般检测4个蛋白，即MLHl、MSH2、MSH6和PMS2。如果任一蛋白丢失即可确定为MSI-H，临床标本中丢失的主要是MLHl和MSH2，后两者较少。免疫组织化学方法方便易行，但仅能作为初筛。如果这一结果用来指导治疗，必须做5个位点的分子检测。
　　MSI-H结直肠癌大多发生于近端结肠，组织学上多数为黏液性腺癌、未分化癌和髓样癌。间质常有多数的免疫细胞浸润，可有Crohn样反应。应用表达谱芯片，依据基因表达的差异可以将结直肠癌分为MSI-H、MSI-L和MSS，表明两组肿瘤间有明确基因表达的差异。
　　三、KRAS和BRAF突变的意义
　　KRAS基因突变是结直肠癌进展过程中较早发生的事件，近年来备受关注的是基因突变与靶向治疗的关系。临床的大量研究证实，KRAS野生型群体对西妥昔单抗治疗有良好反应，而突变型不能从治疗中获益。一般来说，1／3的结直肠癌患者有KRAS基因的突变。不同实验室的结果略有差异，国内大多报道在40％左右，我们实验室检测600余例，KRAS突变率为44.6％(其中第12位密码子30.6％，第13位密码子12.3％，第61位密码子1.7％)。近年来细胞系研究显示，KRAS不同密码子的突变对治疗的反应不同。第13位密码子突变与不突变细胞系比对C-225治疗后生长曲线没有影响，动物实验也有类似结果。人体实验中，G13D突变者似乎可以从西妥昔单抗联合一线化疗的治疗中获益，但不能从帕尼单抗治疗中获益。因此，这个结果还不能用于临床，还遵循表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂不能应用于任何KRAS突变的患者，包括G13D。在KRAS野生型患者中，其他RAS突变率约为17％。如果剔除这些突变，纯粹的KRAS突变与野生型比较，野生型患者接受抗体靶向治疗的效果更明显。
　　KRAS野生型患者接受EGFR抑制剂靶向治疗有两个问题。一个问题是一部分患者在几个月、半年或1年之后产生耐药，其原因可能是KRAS的突变和／或表达增加。这可以是单纯的基因表达增加而没有基因突变，也可能伴有基因的突变。这种突变可能是原先就存在于肿瘤，因突变细胞数量少而未被检测出来。在靶向治疗过程中，野生型的肿瘤细胞都被杀死，而突变型的则大量克隆性增生。也可能是在治疗过程中继发突变，并发生克隆性增生。另一个问题是即使野生型KRAS的患者也只有约60％左右对抗体靶向治疗有反应。因此，还有其他基因影响靶向治疗的反应性，我们还需对这部分患者进行分层。
　　BRAF是同一信号通路中KRAS的下游分子，在结直肠癌中的突变率不到10％。它的突变可以产生与KRAS突变相同的效果。目前确定BRAF突变有以下特点：(1)KRAS突变与BRAF突变往往相互排斥，不会同时存在。因此，一般建议先检测KRAS是否突变，如没有突变再检测BRAF。随着二代测序技术的发展，两者同时存在的可能性也是存在的，因为我们现在检测的是突变热点，而非全基因组。(2)BRAF突变热点总是V600E。(3)BRAF突变出现于散发性MSI-H结直肠癌而不会在HNPCC中出现，因此BRAF突变检测对MSI-H肿瘤的进一步分层有鉴别价值。在散发性MSI-H结直肠癌，BRAF突变常伴随CIMP的出现，因此出现hMLH1启动甲基化而使蛋白表达缺失。(4)BRAF具有提示预后的价值。结合MSI检测可以将结直肠癌分类，BRAF野生型MSI-H结直肠癌预后最好，而BRAF突变的MSS预后最差。BRAF突变MSI-H和BRAF野生MSS处于中间。另一组研究不考虑MSI状态，只分析KRAS与BRAF突变与预后的关系，也证明BRAF突变有预测预后的价值。在KRAS野生型的结直肠癌中，BRAF野生型的预后比突变型的好。如果不考虑KRAS突变状态的总结直肠癌群体中只考虑BRAF状态，则BRAF突变与否没有预后预测价值。PIK3A和PTEN表达缺失也有类似效应。低表达组的治疗效果优于高表达组。
　　四、与靶向治疗相关的其他标志物
　　近年来文献报道了一些其他与靶向治疗有效性相关的标志物，但还没有作为临床强制性检测的指标。
　　1．血管内皮生长因子(VEGF)与贝伐单抗：贝伐单抗是抗VEGF单克隆抗体，两者的结合阻止了VEGF与受体的结合，从而抑制了血管的新生。Ⅲ期临床试验表明贝伐单抗与化疗结合，疗效明显优于单纯化疗组，可有效延长患者的无病生存时间。组织芯片免疫组织化学研究显示，在VEGF A、B、C、D中，唯有VEGF D的表达可以作为贝伐单抗治疗有效性的预测因素。VEGF D低表达组效果好。
　　2．Maspin表达与化疗：丝氨酸蛋白酶Maspin(serpin B5)在低分化区域或低分化肿瘤中高表达，肿瘤浸润前缘细胞核常阳性。Dietmaier等报道1组Ⅲ期患者的研究，他们以Maspin核阳性与胞质阳性与否分为两组。分层分析发现核阳性组较核阴性组预后差。胞质阳性与阴性组生存时间略有差异，胞质阴性组生存稍长，但没有达到有统计学意义。再以Maspin核阳性作为单独一组，分析是否接受5-FU治疗对生存的影响，结果发现对核Maspin阴性的患者，接受5-Fu治疗组生存率与不接受治疗组相比没有差异。而核阳性组接受5-FU治疗组其生存率明显延长。因此可以下这样的结论，肿瘤细胞Maspin阴性的患者不应接受5-FU治疗，而核阳性的患者应该接受5-FU治疗，并可从此治疗中获益。
　　五、SNP与化疗
　　以往证明一些单核苷酸位点的多态性与某些化疗药物的有效性和毒性作用有关，对其的检测可以帮助临床医师选择正确的药物和确定有效的剂量。
　　1．UGT1A1：尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UGT)启动子区TA多态性与伊立替康的毒副作用有明显关系。如伊立替康剂量过大，患者可出现严重的腹泻和白细胞减少，副作用的出现影响进一步治疗，严重者将危及患者生命。启动子TA重复以(TA)。为常见，属于野生型，酶活性强，少见有毒副作用。(TA)5、(TA)8和(TA)7少见。(TA)7又称UGT1A1*28，纯合子患者少见，但酶活性很低。如果用与(TA)。纯合子患者同等剂量的伊立替康，50％的患者会出现严重的毒副反应，因此UGF1A1*28患者应用小剂量的药物，在产生疗效的同时副作用减少。(TA)6／(TA)7杂合个体酶的活性也有降低，如用相同剂量有12.6％患者会表现毒副作用。对这部分患者临床应根据治疗反应调整剂量。所幸的是中国人群UGT1A1*28野生型的比例高于白种人，因此产生毒副作用的概率也相应降低。
　　2．其他SNP位点：二氢嘧啶脱氢酶多态性(DPD)、EGFR、GSTP1、ERCC 1(exsicion repair cross-complementing group 1)、XPD (xeroderma pigmentosum D)、XRCC 1(X-rayrepair cross complementing 1)和TYMS(thymidylatesynthetase)多个位点多态性都与某些药物的毒性和有效性有关。这些多态性位点的检测有助于临床选择正确的剂量使患者获益，在提高生存率的同时，提高生活质量。

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