微小RNA在炎症性肠病中的研究进展

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：陈芳，张璐，范一宏（浙江中医药大学附属第一医院消化科）

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炎症性肠病主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病，是发生在消化道的一种慢性非特异性炎症性疾病，近年来，我国患病人数呈显著上升，其病因及发病机制仍不清楚。目前大多数学者认为遗传易感性、环境因素、肠黏膜免疫调节异常、肠道感染、肠黏膜屏障功能紊乱等因素共同参与了该疾病的发生与发展[1，2]。

　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码单链小分子RNA，长度约18~23个核糖核苷酸，进化中高度保守，是基因表达的关键调控分子。它主要通过与靶基因mRNA 3′非翻译区的完全或不完全配对，使靶基因mRNA降解或沉默，从而对蛋白编码基因进行转录后调控。近年研究发现，靶基因mRNA的某些5′非翻译区和氨基酸编码序列也存在miRNA的配对区域[3，4]。在某些情况下，比如细胞周期停滞时，miRNA也能从抑制翻译的角色转变为上调靶基因mRNAs翻译的角色[5]。miRNA通过调节基因表达在细胞增殖、生长发育、代谢、分化、凋亡等过程发挥作用。本文就miRNA在炎症性肠病中的差异表达、功能研究、与肠黏膜屏障关系作一综述。

一、miRNA在炎症性肠病中的差异性表达
2008年，Wu等[6]利用miRNA芯片及荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT－PCR）检测了活动期UC、缓解期UC、慢性活动期克罗恩病、肠易激综合征、镜下结肠炎和健康对照组的乙状结肠活检组织，发现了在活动期UC患者中明显差异性表达的11种miRNA，包括8种上升的miRNA（miR－16、－21、－23a、－24、－29a、－126、－195和let－7f）及3种下降的miRNA（miR－192、－375、－422b）。其中miR－21和miR－192是结肠组织中与UC相关的最重要的miRNA。该研究小组用同样方法对5例结肠型、6例小肠型克罗恩病患者的肠黏膜组织进行检测，发现与正常对照组相比，结肠型患者肠黏膜组织有3种miRNA（miR－23b、－106a、－191）表达水平明显升高，而miR－19b、miR－629明显下降，小肠型患者肠黏膜组织有4种miRNA（miR－16、－21、－223、－594）表达水平明显升高，且结肠型克罗恩病的表达谱与小肠型克罗恩病的表达谱不存在重叠[7]。随后，该研究组还研究了克罗恩病、UC患者外周血中的miRNA，发现9种miRNA在UC患者外周血中表达异常（上调：miR－28－5p、－151－5p、－103－2、－199a－5p、－340、－362－3p、－532－3p、miR－plus－E127，下降：miR－505），其中miR－505在活动期UC患者明显表达下降，而miR－103－2和miR－362－3p在活动期UC患者血清中上升最明显[8]。活动性克罗恩病患者中miR－199a－Sp、miR－362－3p、miR－340、miR－532－3p、miR－plus－E1271显著上调，miR－149和miR－1056显著下调。且活动期UC、非活动期UC、活动期克罗恩病、非活动期克罗恩病的miRNA表达也有差异，该研究认为可以通过外周血中miRNA的表达水平差异区别活动性克罗恩病、活动期UC、非活动期克罗恩病、非活动期UC，表明相关miRNA可作为潜在的UC和克罗恩病临床诊断指标。该研究结果与肠黏膜组织中的结果并不完全相同，提示两类标本中异常表达的miRNA亚型也不同，检测外周血miRNA并不一定能准确反映病变组织miRNA变化，其可能反映的主要是循环白细胞中的变化情况。Fasseu等[9]研究了克罗恩病和UC患者肠道黏膜组织中miRNA的表达情况，结果显示miRNA在缓解期表达也明显异常，例如miR－196a在缓解期UC患者中比健康对照组表达明显上调，这可能会增加患者对炎症性肠病诱发因素的敏感性，造成炎症性肠病的发生。

　　综上，miRNA在炎症性肠病肠黏膜组织及外周血中的表达存在差异，且这种差异与疾病活动度、病变部位有关。此外，miRNA可结合于与炎症性肠病发病有关的一些细胞因子的mRNA的3′非翻译区，对其进行转录后调控，来参与炎症性肠病的形成与发展。


二、miRNA在炎症性肠病中的功能研究
miRNA主要通过与靶基因mRNA 3′非翻译区的完全或不完全配对，使靶基因mRNA降解或沉默，从而对超过30%的蛋白编码基因进行转录后调控[10]。每个miRNA可以对应数个靶基因，而一个特定基因也可以是数个miRNA的靶基因，这使得miRNA对靶基因的调控网络更加复杂[11]。

1.miRNA与细胞自噬：

　　自噬作用（autophagy）是一个细胞内自我消化废弃材料的过程，如损坏线粒体产物和病原微生物。这个过程需要多种蛋白，如波形蛋白、NOD2、IRGM蛋白，和多蛋白复合物（ATG16L1和ATG5－ATG12）的协同作用。目前所有已知的自噬相关基因都被miRNA调控[12]。其中，IRGM、ATG16L1等基因与克罗恩病的发病机制密切相关[13]。另外，克罗恩病相关的NOD2单核苷酸多态性与ATG16L1相互作用，在由肠上皮细胞调节自噬和细菌清除中发挥作用。虽然已经有较多的miRNA在某些癌细胞系中直接调控自噬信号通路和活动，但它们在调节自噬和肠上皮细胞清除细菌的作用是新近被阐明的，而这也是克罗恩病的重要发病机制之一[14]。

　　2.miRNA与ATG16L1调控：

　　全基因组关联研究（Genome－Wide Association Studies）确定ATG16L1多态性（T300A）是克罗恩病的风险因素。进一步的研究显示，这种变异会导致机体无法清除某些病原体，如鼠伤寒沙门菌[15]。miR－106a是最早报道的在炎症性肠病患者中差异表达的miRNA之一，其属于miR－17家族，且miR－17家族已确定多个自噬相关靶基因，包括ATG16L1。利用体外细胞系，Zhai等[16]首次确定了miR－106b的靶基因ATG16L1，miR－106b通过结合到靶基因ATG16L1的3′非翻译区，从而降低了其表达量并且抑制了自噬作用。此后，Lu等[17]证实miR－106b和miR－93的靶基因也是ATG16L1，在活动期克罗恩病患者中增加的miR－106b的表达与下调的ATG16L1相关。紧接着，Zhai等[18]利用同样的细胞系确定了miR－142－3p过表达会导致ATG16L1mRNA、蛋白水平及自噬活动的下调。Nguyen等[19]报道，附着侵袭性大肠杆菌（adherent－invasive Escherichia coli），是一种与克罗恩病发病密切相关的细菌，能使核因子（NF）－κB通路活化，诱导miR－30c和miR－130a的强表达，从而抑制ATG5和ATG16L1的表达。这些研究表明了miRNA调控自噬作用在克罗恩病发病机制中的重要性，这也为未来的治疗提供了新思路。

　　3.miRNA与IRGM调控：

　　IRGM编码一种参与固有免疫的自噬相关蛋白，其单核苷酸多态性已被证实与克罗恩病的发病有关[20]。Brest等[21]研究发现一种已知的IRGM多态性（c313C>T）位于miRNA结合位点的3′非翻译区，此miRNA即为miR－196。miR－196在克罗恩病患者的肠黏膜组织高表达，能下调IRGM的保护性变体c313C的表达，但不影响相关变体c313T的表达。这说明靶基因mRNA的多态性在miRNA调控中的重要性。

　　4.miRNA与NOD2调控：

　　Chuang等[22]的研究揭示了NOD2 3′非翻译区11个miRNA结合位点，包括2个miR－192结合位点，这提示了miRNA参与调控了NOD2表达和炎性反应。使用HT－29体外结肠上皮细胞培养系统，Chen等[23]证实miR－122的靶基因是NOD2，并且通过NF－κB途径抑制固有免疫系统激活。此后，Chuang等[22]利用HCT－116结肠上皮细胞模型证实了另外4个miRNA（miR－192、－495、－512和－671）通过减弱NOD2信号而抑制固有免疫。人们越来越清楚的是多个miRNA参与NOD2表达的调节，对下游的免疫反应并没有单独与NOD2表达水平关联，这提示miRNA在下游的细胞因子信号通路中也有相应的靶基因。NOD2似乎不仅受miRNA调节，并且也可通过miRNA调解其下游效果。Brain等[24]证实，NOD2能诱导的miRNA家族29a、29b和29c在树突状细胞中的表达，并随着NOD2的活化，miR－29能通过靶向结合IL－23的亚基IL－12p40，从而下调IL－23的产量。此外，来自克罗恩病患者的树突状细胞，在感染附着侵袭性大肠杆菌后，由于NOD2单核苷酸多态性而无法诱导NOD2激活、miR－29和IL－12p40释放。由于此种小肠树突状细胞的免疫功能缺失，导致克罗恩病患者小肠黏膜产生过多的IL－23，加重肠道炎性反应。在临床上，对于抗肿瘤坏死因子（TNF）α治疗无效的中重度克罗恩病患者，优特克单抗（ustekinumab），一种针对IL－12和IL－23的单克隆抗体，可使其受益。


三、miRNA与肠黏膜屏障功能调控
肠黏膜的屏障功能是指正常肠道具有完善的功能隔离带，防止肠腔内致病性抗原（细菌、有毒物质、食物抗原物质、致癌物质等）侵入，使机体内环境保持相对稳定，维持机体的正常生命活动。肠单层上皮细胞与黏液层、肠黏膜相关淋巴组织、益生菌等共同抵御肠道致病菌。肠上皮细胞（intestinal epithelial cell）之间的紧密连接（tight junction）是肠黏膜屏障的重要组成部分。肠上皮细胞能感受肠腔抗原刺激并将信号传递给固有免疫系统和适应性免疫系统，从而启动免疫应答，形成肠道免疫自稳状态，研究发现，肠黏膜屏障缺损与UC的发病机制有关[25]，而miRNA在其中的作用正日益被重视。Wu等[6]的研究发现miR－192在活动期UC患者中的表达较正常对照组降低47.1%，miR－21较正常对照组增加了3.54倍。但前者的降低伴随着巨噬细胞炎性蛋白（MIP－2α）较正常对照组升高32.2倍，miR－192可通过调控MIP－2α的表达间接参与肠道炎性反应与纤维化。Yang等[26]利用体外结肠上皮细胞模型，证实miR－21模拟会导致紧密连接蛋白减少及肠道通透性增加。在糖硫酸钠（dextran sodium sulfate）诱导的结肠炎小鼠模型中，miR－21基因敲除模型鼠较对照组肠上皮通透性降低，肠道炎性反应减少，生存率也更高[27]。类似地，miR－200b通过与靶基因转化生长因子β1结合抑制肠道纤维化以及维持肠黏膜屏障的完整[28]。


四、结语与展望
炎症性肠病相关的miRNA研究在过去7年间迅速发展，尤其是自噬作用相关的功能研究。miRNA作为基因调控者，其作用机制尚未完全被阐明，一个特定的miRNA调控多个靶基因或几个miRNA对某一靶基因的调控值得深入研究。同时，miRNA可作为疾病标志物，通过动态观察miRNA变化也可预测炎症性肠病的疾病阶段以及疾病表型。最后，miRNA相关疗法也成为炎症性肠病靶向治疗的新热点，其技术难点，如靶向运输miRNA至指定组织，仍需探索。

xiaofeng

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