三种过碘酸－银－乌洛托品染色法在肾脏穿刺活检中的应用体会

阳光56

作者：杨眉，唐源（四川大学华西医院病理科）

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　　过碘酸－银－乌洛托品（periodic acid－silver－methenamine，PASM）染色法是一种常用于肾脏穿刺活检特殊染色方法，对于观察肾小球基底膜、系膜的各种形态改变具有极重要的诊断价值，特别是观察膜性肾病基底膜的"钉突"形成、淀粉样变性肾病基底膜的双轨和多轨改变等是其他特殊染色所不可替代的。新月体形成中的基底膜断裂、血管动脉炎中的动脉内膜和弹力纤维的变化也应用PASM染色[1]。由于临床对病理报告及时性的要求不断提高等因素，导致组织固定时间短，固定不充分，加之取材台抽风系统风力大，取材后未及时固定，组织有不同程度的收缩。此时再用传统染色方法染色则时间长易掉片，组织上色效果差。针对以上问题，我科通过实验改变了六胺银工作液的配制顺序并提高硝酸银浓度，取得较好染色效果，现将应用体会介绍如下。

　　一、材料与方法

　　1．材料：
　　选取四川大学华西医院病理科2016年7至8月肾脏穿刺活检标本40例。前期处理方法一致，均由3.7%中性甲醛液固定，固定时间短，小于3h，全自动组织脱水机处理，石蜡包埋，切片厚度2μm，70 ℃烤片2h。

　　2．PASM染色方法共同流程：
　　2μm切片脱蜡至水；1%过碘酸浸染20min；蒸馏水洗3次；切片入六氨银工作液，置于54℃水浴箱（三种不同六氨银工作液配制方法及其相应的染色时间详见下文)；蒸馏水洗3次；0.25%氯化金在显微镜下调色；蒸馏水洗3次；入5%硫代硫酸钠2min；蒸馏水洗3次；1%冰醋酸2min；Masson染液套染30s；蒸馏水洗3次；1%冰醋酸2 min；1%亮绿复染30s；蒸馏水洗3次；脱水，透明，封片。

　　3．三种六氨银工作液配制方法：
　　（1）传统方法：5%硝酸银溶液625μL×2，加入3%六次甲基四胺至25mL震荡至白色沉淀消失，再加入5%四硼酸钠5 mL，最后加入蒸馏水至50mL，现配现用，染色时间80 min。（2）改良方法Ⅰ（改变六氨银工作液顺序）：3%六次甲基四胺25mL，加入5%四硼酸钠5mL混匀，再加入5%硝酸银溶液625μL×2震荡至白色沉淀消失，最后加入蒸馏水至50mL，现配现用，染色时间40min。（3）改良方法Ⅱ（改变六氨银工作液顺序，提高硝酸银浓度）：3%六次甲基四胺25mL，加入5%四硼酸钠5mL混匀，再加入5%硝酸银溶液625μL×3震荡至白色沉淀消失，最后加入蒸馏水至50mL，现配现用，染色时间30min（三种不同方法配制的工作液pH值见表1)。

　　4．Masson染液配制方法：
　　变色酸2R0.6g、磷钨酸0.8g、蒸馏水100mL混匀后加入亮绿0.3g再混匀后加入冰醋酸1.0mL装瓶。

　　二、结果

　　传统方法与改良方法Ⅰ相比，传统方法六氨银染色时间80 min，改良方法Ⅰ六氨银染色时间40min，传统方法肾小球结构模糊，基底膜和系膜勾画不清晰（图1，图2）。改良方法Ⅰ六氨银染色时间40min，组织整体染色深，改良方法Ⅱ六氨银染色时间30 min，组织整体着色浅，肾小球结构清楚，基底膜呈黑色，系膜呈深浅不同的黑色且系膜上有红色（图3，图4）。膜性肾病"钉突"定位清楚，组织通透性高（图5，图6）。

　　图1，2肾脏穿刺活检标本，同一组织 PASM染色 高倍放大，图1为传统染色方法染色结果，图2为改良染色方法Ⅰ染色结果，组织结构清楚
　　图3，4同一组织视野 PASM染色 高倍放大，图3为改良方法Ⅰ染色结果，图4为改良方法Ⅱ染色结果
　　图5，6同一组织视野 PASM染色 高倍放大，图5为改良方法Ⅰ染色结果，图6为改良方法Ⅱ染色结果

　　三、讨论

　　PASM染色的基本原理是肾小球基底膜和系膜区等部位的蛋白多糖被过碘酸氧化后暴露出醛基，醛基再把六胺银还原为黑色的金属银，然后再套以Masson染色，染色结果能清晰的显示基底膜、系膜的病变和免疫复合物的沉积情况[2]。肾脏疾病常导致基底膜和系膜区的改变，所以PASM染色质量的好坏对临床诊断有很大影响[3]。

　　在临床工作中PASM染色受到很多因素影响，如标本固定不及时、不充分等导致组织收缩，收缩后组织结构空隙窄、渗透性低，相应的醛基暴露不完全，六氨银不能完全还原成黑色金属银，肾小球基底膜着色时间长且效果差。有文献报道，用硫酸铁铵作为媒染液增强银氨液的选择性，但是对水洗要求高[4]。我们在3%六次甲基四胺液中先加5%四硼酸钠液，使溶液碱性增强后再加硝酸银。因为溶液的酸碱性对螯合物的稳定性有影响，六次甲基四胺四硼酸钠液减弱了六次甲基四胺螯合银离子的稳定性，这样银离子极易被游离的醛基还原而在毛细血管基底膜上产生棕黑色的沉淀[5]，缩短了染色时间。

　　改良方法Ⅱ提高硝酸银浓度后pH值较改良方法Ⅰ有所下降（表1）。两种改良方法在相同的染色时间里，改良方法Ⅱ上色快，组织整体着色浅，通透性高，无掉片现象发生。由于我科自制蒸馏水pH值有小范围波动；测量pH值时，溶液温度不同pH仪所测值亦不同，如已配制好的六次甲基四胺液存放于4 ℃冰箱，新配制六次甲基四胺液的温度则是室温25 ℃，这两种情况所测得pH值亦不同。所以每次测得pH值均有变化，但测量值在0.1左右波动。六氨银工作液放入水浴箱加热40min后，无论是否放入组织切片溶液pH均下降0.2左右。我们认为就改良方法Ⅰ、Ⅱ而言，pH值并不是影响染色结果主要因素，而是硝酸银浓度。硝酸银浓度提高后，银离子与醛基的作用更充分，组织在短时间内可以快速上色，无过多的背景着色组织通透性高，则银离子着色更符合组织本身病变情况。若再提高硝酸银浓度则肾小管中出现较多银离子沉淀。

　　综上所述，改良方法Ⅱ染色效果良好且更稳定，适于肾脏穿刺活检染色。但是要根据组织的前期处理情况、染液的新旧程度等适当调整染色时间，避免组织不上色或过染。

xiaofeng

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