液态阳性对照在EB病毒编码小RNA原位杂交染色质量控制中的应用

阳光56

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EB病毒编码小RNA(EBER)原位杂交在病理工作中应用十分广泛，但最让医师担心的是由于各种原因引起的假阴性，在无阳性对照的情况下无法判别染色是否成功，极易引起误诊，导致临床治疗方案的不同，造成无法挽回的后果。但由于现有的阳性对照方法费时、费力、步骤繁琐，在很多实验室都没有很好的普及应用。近年来，我们找到了一种简单、快捷、方便、容易制备的液态阳性对照方法应用于免疫组织化学染色[[url=]1[/url]]，通过反复实验，我们在EBER原位杂交实验中也取得了满意的结果，现介绍如下。

一、材料和方法

1．组织切片匀浆液制作方法：

(1)选择合适的EBER阳性组织蜡块是本方法的关键之一，尽可能选择肿瘤细胞多的组织，阳性细胞占细胞总量70%以上，纤维结缔组织少的蜡块；如果肿瘤周围存在正常组织，最好切去。如果是重新取材标本，可直接取肿瘤细胞；也可以将阳性细胞用组织芯片方法取样、集中后再包埋。(2)快速连续切片3～4 μm 50～200张(根据肿块大小、需要配制的量多少决定，一般直径1 cm大小的组织，连续切片100张，可制备10～20 mL组织、细胞切片匀浆液，相当于5 000～8 000张左右的阳性对照)。(3)将切片放入50 mL试管内。(4)用玻璃棒轻轻将切片碾碎成细颗粒状。(5)加入40 mL二甲苯用玻璃棒反复搅拌至所有石蜡溶解(将肉眼所见试管壁上及底部的白色物质全部消失)。(6)离心：3 000 r/min，2 min。(7)倒出二甲苯。(8)在试管内加入无水乙醇40 mL，用玻璃棒搅拌，将沉淀物混匀(如果有絮状物，往往是纤维结缔组织，可用镊子去除)。(9)离心：3 000 r/min，2 min。(10)倒去无水乙醇，以沉淀物体积1∶30左右的量加入75%～100%乙醇(将此液1.5～2.0 μL滴加在载玻片上，干燥后苏木精染色，镜下观察肿瘤细胞，成小片状或单个散在分布，以100～1 000个为佳，如果细胞成分过多、细胞重叠，可再适量加入乙醇；如果细胞成分过少，离心后适量吸去上清液)，装入干净的滴瓶中，贴上标签，注明阳性对照名称、配制时间。(11)组织切片匀浆液配制完成，放入－20 ℃冰箱备用。(12)在切片准备工作完成后，将组织切片匀浆液摇匀，用10 μL加样枪吸取，在被检切片周边滴加组织切片匀浆液1～2 μL(不能将切片匀浆液加在蜡片上)。然后放入60 ℃温箱内烤片过夜。

2．实验方法：

根据EBER原位杂交试剂盒步骤操作，采用手工染色方法，每隔3个月(共15个月分6次)对阳性对照的染色强弱和定位进行比较。

二、结果

EBER原位杂交切片液态阳性对照无一脱片，15个月前后组织切片匀浆液的阳性表达强度、定位结果完全一致([url=]图1[/url],[url=]图2[/url], [url=]图3[/url], [url=]图4[/url], [url=]图5[/url], [url=]图6[/url])。

图1~6

EBER原位杂交切片液态阳性对照配制当天～15个月的对比实验结果，图1～6分别为液态阳性对照配制的配制当天、3、6、9、12、15个月的染色结果　原位杂交　中倍放大

三、讨论

阳性、阴性对照是做好EBER原位杂交质量控制最好的方法，现有的取"阳性组织"、"香肠组织包埋"[[url=]2[/url]]、"基因芯片"[[url=]3[/url]]等作为阳性对照的方法，消耗阳性组织过多、操作繁琐、工作量增加一倍以上，因此，很难在各级医院病理科广泛使用。组织切片匀浆液方法选材方便，只要选择以往做过的阳性蜡块进行切片，组织用量较少，没有废片，不会造成浪费；一只蜡块可代表多种抗原的阳性表达；同时可以先在镜下观察，在蜡块上去除阳性对照不需要的组织，保证其阳性细胞的成分；制作方便，无需专用工具，制作全过程只需20 min左右；保存时间长，配制可用1年以上；滴加方便，每加一张阳性对照只需要1～2 μL，用时1～2 s，并不会增加多少工作量；干燥迅速，一般只需要5～20 s。其阳性强度及定位与原切片完全相同，染色结果稳定可靠，可长期保存。因此，组织切片匀浆液不仅可以使EBER原位杂交检测阳性对照规范化、普及成为现实，同时也可以应用于免疫组织化学阳性对照。此项技术具有较高的实用性，可以在全国各级医院病理科和科研实验室广泛推广使用。

• [url=]丁伟[/url]
• [url=]王波[/url]
• [url=]徐黎明[/url]
  

中华病理学杂志, 2017,46(01): 53-54.

xiaofeng

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