高迁移率族蛋白B1介导血管内皮屏障功能障碍及对白细胞-内皮细胞黏附的调节作用

阳光56

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高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1 protein, HMGB1)是一种非组蛋白染色质结合蛋白，存在于几乎所有细胞的细胞核和细胞质中。近期研究表明，HMGB1可被分泌到细胞外，作为一种炎性细胞因子参与组织损伤的病理生理过程及参与免疫应答反应。大量研究表明HMGB1在介导血管内皮屏障功能障碍和调节黏附分子表达中起重要作用。HMGB1通过跨细胞途径促进白细胞黏附和迁移，调节黏附分子的表达和磷酸化并改变紧密连接蛋白的分布和表达，最终可导致血管内皮屏障(如血-脑屏障、血-视网膜屏障)功能的破坏。我们就HMGB1介导血管内皮屏障功能障碍和HMGB1与细胞表面受体间相互作用及介导细胞内信号转导通路作一综述。

HMGB1拥有"双重活性"，作为核内高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，除转录调节功能外，在免疫应答中HMGB1可由不同类型的细胞主动分泌(包括单核细胞、巨噬细胞、成熟的树突状细胞、自然杀伤细胞及内皮细胞)，同时HMGB1参与了严重脓毒症时多器官功能衰竭的病理生理过程[[url=]1[/url]]；而广泛的内皮细胞损伤和微循环功能障碍是脓毒症晚期动物死亡的主要原因[[url=]2[/url]]。

此外，细胞死亡后HMGB1由细胞漏出，不再被DNA束缚；HMGB1在炎性反应中扮演着重要角色，除可介导组织损伤及血管生成外，还参与早期脓毒症神经功能障碍的病理生理过程[[url=]3[/url],[url=]4[/url]]。目前研究表明，HMGB1可致增生性糖尿病视网膜病(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，提示HMGB1可能参与微血管炎性病变的病理生理过程[[url=]5[/url]]。HMGB1作为脓毒症晚期炎性因子，可介导心肌出现不可逆的结构破坏[[url=]6[/url]]。目前HMGB1激活免疫系统，参与炎性反应的具体分子机制还没有完全清楚。然而新近研究发现，HMGB1通过与其他因子相互作用，可激活免疫系统[[url=]7[/url]]。通过这些机制介导炎性病变、癌症、脓毒症或其他复杂的微血管炎性疾病。

糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)，是免疫球蛋白超家族中的一员，被认为是HMGB1的主要受体，可诱导核因子κB (NF-κB)的激活，引发各种白细胞黏附分子和促炎细胞因子的表达[[url=]5[/url]]。研究证实Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是HMGB1信号转导识别受体，是一类跨膜蛋白质分子，参与机体的非特异性免疫，在识别外来微生物分子或病原体中起重要作用。HMGB1能与TLR2、TLR4结合，激活中性粒细胞及巨噬细胞MyD88依赖的NF-κB信号通路，进而促进炎性反应。TLR和RAGE与HMGB1相互作用可介导炎性介质的表达[[url=]8[/url]]。

大量研究证实，HMGB1可增加内皮细胞黏附分子的表达，包括细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)，可上调炎性介质如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白(MCP)1和纤溶酶原激活物抑制剂1等的表达。HMGB1与RAGE结合，增强白细胞的趋向性，通过诱导生长因子、细胞因子及一些黏附分子，如IL-8、TNF-α、G-CSF、MCP1、血管内皮生长因子(VEGF)、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin介导免疫细胞的成熟与迁移，继而促进白细胞的黏附与迁移，介导炎性反应的发展。近期有研究证实HMGB1通过改变紧密连接蛋白的表达和分布介导血-脑屏障和血-视网膜屏障的破坏。我们总结了HMGB1介导的血管内皮屏障功能破坏的信号转导通路及相应拮抗HMGB1潜在的方法。其中一些研究结果都是基于实验室条件下而获得的，而现今的临床试验仅仅处于初级阶段。

一、HMGB1的起源与结构

HMGB1属于alarmin，存在于人类编码基因13q12-1。脓毒症时，此蛋白高表达于组织和血液中。人类及啮齿类动物(老鼠或鼠类)同源性达98%以上，哺乳动物同源性高达98.5%[[url=]9[/url]]。在结构上，HMGB1蛋白由215个酸性和碱性氨基酸组成，相对分子质量在30 000左右。HMGB1结构上可分为两个同源性DNA结合区：A区和B区，以及一个酸性C末端。A区是特殊的DNA绑定结构；弯曲结构构成B区；这种蛋白质的酸性尾端有助其保持弯曲结构的稳定。其一级结构中存在3个未配对的半胱氨酸残基(C23、C45、C106)，它们是HMGB1具有至关重要的生物活性位点，其中残基C23和C45在分子内形成二硫键，是HMGB1保持炎性活性的位点。此外，HMGB1参与调节细胞分化也有赖于这3个半胱氨酸残基。因此，HMGB1在基因转录、重组、复制、组织修复及炎性反应等方面均起到了重要的调节作用。

二、HMGB1与先天免疫

炎性反应是通过可溶性细胞因子的释放、血管通透性的增加、白细胞的游走等因素实现的免疫应答过程[[url=]10[/url]]。其中血液中的白细胞游走浸润炎性组织，可维持并加重炎性反应。在免疫应答时，细胞核内的HMGB1可分泌至细胞外，参与介导炎性反应过程。细菌内毒素脂多糖可诱导单核细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞等炎性相关细胞分泌大量细胞因子和炎性介质(血清中HMGB1表达水平也会相应提高)，引发全身炎性反应。HMGB1的结合受体有RAGE和TLR等[[url=]11[/url]]。RAGE为一种膜蛋白，可在多种细胞中表达的免疫球蛋白超家族成员，与细胞增殖分化相关，并可介导白细胞跨内皮细胞屏障迁移，通过应用抗RAGE拮抗剂可有效抑制单核细胞的跨细胞迁移[[url=]11[/url]]。HMGB1通过RAGE激活促细胞分裂原活化蛋白激酶、NF-κB及细胞分裂周期蛋白42/Rac等多种信号转导机制引起炎性介质表达增加及发挥其生物效应。TLR是一类跨膜蛋白质分子，参与机体的非特异性免疫，可识别外来微生物分子模式或病原体相关分子模式。HMGB1可结合表面的TLR受体，活化衔接蛋白髓样分化因子88、TNF受体相关因子等，进而激活NF-κB，参与炎性反应。有研究报道，TLR2和TLR4作为HMGB1的受体可参与HMGB1的信号转导，促进炎性反应。

三、HMGB1与白细胞黏附

组织损伤可引发炎性反应，白细胞可向损伤和感染部位大量迁移，白细胞通过黏附、浸润、游走作用于炎性部位，是炎性反应的主要特点。白细胞的溢出至少包括5个阶段：捕获、旋转、缓慢旋转、牢固黏附、迁移。而这5个阶段是受高度调控的，拮抗或抑制任何阶段均可降低白细胞的聚集率。早期研究主要集中于了解在这些复杂进程中受体与配体是如何相互作用并如何调节白细胞黏附的。众所周知，在炎性反应部位，白细胞与内皮细胞通过白细胞表面的CD11和CD18与内皮细胞表面的ICAM-1和VCAM-1的相互作用而黏附。大量炎性介质如血小板激活因子、白三烯B4和TNF-α可促进这些黏附糖蛋白的表达，从而促进白细胞向局部组织的黏附和迁移。血管内皮细胞表面有大量中性粒细胞黏附标志着组织有明显的炎性反应发生。而炎性反应产生的细胞因子又可促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附。近期一些研究表明在免疫应答中单核细胞、巨噬细胞、成熟的树突状细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞等可释放大量的HMGB1。HMGB1通过与RAGE和TLR等受体结合激活细胞内信号转导通路，引发白细胞黏附分子、细胞因子与趋化因子的大量表达。研究表明HMGB1与内皮细胞表面的RAGE结合后，可引起白细胞的激活与聚集并促进血管内皮细胞与白细胞黏附[[url=]12[/url]]；在肝损伤和溃疡性结肠炎大鼠模型中发现，应用HMGB1特异抑制剂可抑制HMGB1介导的白细胞黏附，并降低ICAM-1的表达。HMGB1介导的内皮细胞与白细胞的黏附机制，目前并未完全清楚。

四、HMGB1与血管内皮屏障

血管内皮屏障的结构是维持内皮屏障通透性的基础，正常情况下参与调节血液、脑脊液和视网膜中物质运输和交换；维持内皮屏障正常的生理功能，对于维持组织细胞的正常生理功能具有重要意义。微血管内皮屏障功能障碍存在于炎性反应的初期和各类血管炎相关疾病的并发症中，如创伤性炎性病变、急性卒中、缺血再灌注损伤、脓毒症、动脉粥样硬化及视网膜疾病等。而来自同一胚胎原基的血-脑屏障及血-视网膜屏障分别具有防止有害物质及微生物入侵大脑和视网膜的功能。大脑血管内皮细胞具有特殊的紧密连接结构，不同于体内的其他内皮细胞和上皮细胞。血-脑屏障与血-视网膜屏障对于维持组织内环境稳态的功能是相似的。血-视网膜屏障分内外两层，内部是由视网膜毛细血管内皮细胞组成，外部是由紧密连接的视网膜色素上皮细胞组成，通过血-视网膜屏障可高度选择性扩散物质。阻断血-脑屏障和血-视网膜屏障是造成脑水肿和视网膜功能障碍的重要因素。可溶性炎性介质与细胞因子(IL-1、TNF)、内皮生长因子(TGF-β)和一氧化氮均可以导致血管内皮屏障通透性增加[[url=]13[/url]]。新近研究发现HMGB1可导致血-视网膜屏障的崩溃，进而引发黄斑水肿和视力丧失[[url=]14[/url]]。Occludin蛋白和Claudins蛋白是内皮细胞的紧密连接蛋白，与内皮屏障通透性密切相关[[url=]15[/url]]。在血脑屏障中Claudin-5可阻止小分子物质(相对分子质量<800)通过血脑屏障；Claudin-5在血-视网膜屏障中也起着相似的作用。研究表明HMGB1可降低牛视网膜内皮细胞的电阻率；在小鼠模型中，HMGB1可下调Claudin的表达，进而增加视网膜血管内皮通透性。此外，HMGB1与纤溶酶原结合可产生纤维蛋白溶酶；HMGB1与组织纤溶酶原激活物(t-PA)结合可诱导产生基质金属蛋白酶，通过t-PA与基质金属蛋白酶的激活，可降解细胞外基质成分进而增加内皮通透性，促进免疫细胞的迁移[[url=]16[/url]]。基质金属蛋白酶可降解血管基膜，并削弱已经退化的血-脑屏障紧密连接蛋白(Occludin、Claudins)表达与分布。而应用抗HMGB1单抗可高效清除HMGB1，维持血-脑屏障通透性，抑制脑水肿的发展；因此，有研究认为抗HMGB1单抗或许是治疗脑缺血的一种有效策略[[url=]16[/url]]。

五、HMGB1介导的信号通路

HMGB1可促进白细胞与C-X-C基序趋化因子12(CXCL12)相互作用，CXCL12也称为基质细胞源性因子1(SDF-1)，HMGB1与白细胞CXCL12结合后形成HMGB1-CXCL12杂合物；该杂合物作用于C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)的效能要比CXCL12单独作用强[[url=]17[/url]]。另外，研究发现在一些损伤模型中，HMGB1通过与TLR4相互作用诱导促炎基因的转录，参与炎性反应[[url=]18[/url]]。HMGB1具有化学趋化活性和促炎活性，在不同的炎性阶段HMGB1具有不同的活性，HMGB1的炎性活性取决于3个半胱氨酸残基C23、C45、C106的氧化还原状态[[url=]19[/url]]。

损伤后即刻，在细胞外大部分HMGB1的3个半胱氨酸残基C23、C45、C106均处于还原状态，此时HMGB1活性状态利于白细胞向炎性部位趋化聚集。炎性初期几小时后，产生的活性氧介质(ROS)可部分氧化细胞外的HMGB1，间接产生二硫化的HMGB1(C106巯基化和C23-C45形成二硫键)；而二硫化的HMGB1可刺激促炎细胞因子的大量释放。而在整个炎性期间，不断生成的ROS会通过诱导HMGB1末端氧化而最终灭活HMGB1。RAGE与配体结合后可以活化两条主要的信号通路。一条是涉及Rac/CDC42，另一条是关于各种丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)，两者最终均可活化NF-κB依赖的信号转导通路。

RAGE通过激活MAPK通路而活化NF-κB，MAPK通路包括小GTPase Ras和细胞外信号管理激酶ERK1/2。研究表明RAGE与相应配体结合后可以活化p38 MAPK和应激活化蛋白激酶c-Jun N末端激酶(SAPK /JNK)通路，最终可活化内皮细胞并改变内皮屏障功能。p38 MAPK激活后，通过肌动蛋白结合蛋白Hsp27活性的改变可导致内皮细胞屏障功能障碍[[url=]19[/url],[url=]20[/url]]。一些小的信号分子可以直接结合到RAGE的胞质侧区域，最终导致ERK1/2磷酸化、IκB降解和NF-κB依赖的基因表达。事实上，RAGE的启动子区域包含一个NF-κB结合位点；因此，RAGE通过正反馈回路促进NF-κB的活化[[url=]21[/url]]。此外，HMGB1与RAGE结合后可增加RAGE的表达，说明HMGB1介导的RAGE激活可以使其自身表达上调，从而进一步加强NF-κB激活的炎性反应。因此，RAGE被HMGB1活化后，可作为炎性反应的启动者和维持者，介导血管内皮屏障的损害。新近研究发现HMGB1通过RAGE和Scr家族酪氨酸激酶通路可增加单层内皮细胞屏障通透性；应用中和抗体或小干扰RNA(siRNA)技术阻断RAGE或用特定抑制剂抑制Src家族酪氨酸激酶可以改善HMGB1诱导的内皮屏障高通透性[[url=]22[/url]]。

六、潜在的治疗靶点

研究表明HMGB1参与一些疾病的病理生理过程，如动脉粥样硬化、炎性病变、脓毒症、关节炎、癌症和糖尿病等。因此，HMGB1就有可能成为一个潜在的治疗靶点。RNA干扰技术是消除或降低靶基因的表达最常用的方法。此技术已应用于一些炎性疾病的治疗，如缺血性损伤。在大鼠脑缺血动物模型中，应用siRNA技术使HMGB1作为目标基因"沉默"后观察治疗效果。研究表明，通过siRNA技术可抑制脑组织中病变区域HMGB1的表达和释放，减轻脑组织损伤[[url=]23[/url]]。在HMGB1介导的血-脑屏障通透性增加的脑部疾病中，应用HMGB1抗体可明显改善疾病的严重程度。抗HMGB1单抗通过剂量依赖的方式中和HMGB1后，可有效的抑制单核细胞跨内皮迁移[[url=]12[/url]]。此外，抗HMGB1可能是糖尿病并发症(糖尿病肾病、视网膜病变等)合适的治疗靶点。这可能与HMGB1参与细胞凋亡的调控、神经变性退化、炎性病变和血管生成有关。另外，在感染的24 h内给予抗HMGB1抗体还可以明显改善脓毒症动物的症状及病死率。新近，研究表明HMGB1参与介导血管内皮屏障的破坏及白细胞-内皮细胞的黏附、迁移[[url=]24[/url]]。研究表明，一些天然或合成的化合物可以改善内皮屏障功能或抑制白细胞与内皮细胞的黏附并为受损组织提供保护作用[[url=]25[/url]]。如迷迭香酸，在大鼠炎性损伤模型中可抑制HMGB1介导的白细胞促炎活性[[url=]24[/url]]。研究发现许多化合物，如非瑟酮、穿心莲内酯和芸香苷是已知的抗病毒和抗炎物质，可抑制由HMGB1介导的内皮细胞屏障通透性增加和白细胞与内皮细胞的黏附游走[[url=]26[/url],[url=]27[/url]]。目前，新的治疗药物在临床试验方面尚未开展或仅在早期阶段。研究表明糖尿病视网膜病变时，Occludin表达下调，血-视网膜屏障破坏；应用甘草酸苷抑制HMGB1活性，可缓解糖尿病的血-视网膜屏障通透性。乳糖衍生物GU4可抑制HMGB1介导的白细胞与内皮细胞之间的相互作用[[url=]28[/url]]。同样，Iba等[[url=]29[/url]]研究证实，在鼠灌注脂多糖致脓毒症模型中，重组血栓调节蛋白具有抑制HMGB1的作用，可抑制白细胞与内皮细胞之间的反应。肝素与HMGB1相互作用，可抑制HMGB1与其受体相互作用，进而抑制HMGB1的促炎反应及HMGB1介导的内皮细胞屏障破坏，保护内皮细胞屏障的完整性。

总的来说，在炎性疾病的病理生理过程中，HMGB1扮演多个角色，包括凋亡、促炎和血管生成等。本文就HMGB1参与调节白细胞与内皮细胞黏附并介导内皮细胞紧密连接屏障的破坏及相关的信号转导通路作一综述。为全面认识HMGB1的作用提供新见解并为HMGB1相关疾病的治疗提供新依据，为改善血-脑屏障或血-视网膜屏障通透性提供新的思路。

• [url=]吴蕾[/url]
• [url=]栾正刚[/url]
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中华病理学杂志, 2017,46(01): 64-67.

xiaofeng

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