SOX11促进浸润性生长和导管原位癌的发展 （主要内容翻译）

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　　马东慎/翻译 刘慧/审校
　　原文题目： SOX11 promotes invasive growth and ductal carcinoma in situ progression
　　原文出处： The Journal of Pathology
　　原文链接： europepmc.org/articles/PMC5637904
　　原文作者： Erik Oliemuller1, Naoko Kogata1, Philip Bland1, Divya Kriplani1, Frances Daley1, Syed Haider1, Vandna Shah2, Elinor J Sawyer2 and Beatrice A Howard1*
　　1 The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre, Division of Breast Cancer Research, The Institute of Cancer Research, London, UK
　　2 Research Oncology, Guy's Hospital, King's College London, London, UK
　　*Correspondence to: BA Howard, The Breast Cancer Now Toby Robins Research Centre, Division of Breast Cancer Research, The Institute of Cancer Research, London, SW3 6JB, UK. E-mail: beatrice.howard@icr.ac.uk.
　　介绍：
　　胚胎乳腺上皮细胞构成独特的细胞群，这群细胞由未分化的、高度可塑性的祖细胞组成，最终发育为所有其他出生后的乳房上皮细胞谱系。越来越多的证据表明，肿瘤干细胞或干细胞样细胞存在于癌细胞中，并能够在许多实体瘤治疗后维持癌细胞的生长。在皮肤、肠道和大脑中都存在肿瘤干细胞，它们与负责生长和更新身体组织的健康干细胞非常相似。谱系追踪研究表明，胚胎乳腺上皮细胞（MECs）在体内是多能的，但是它们在乳腺癌中的作用还不清楚。肿瘤可能从处在细胞分化不同阶段的祖细胞样细胞中发育而来，而胚胎乳房祖细胞与乳腺癌的潜在联系还有待探索。
　　作者分析了胚胎小鼠乳腺基因标志，并发现胚胎乳腺细胞和乳腺癌细胞之间有明显的相似之处。作者发现，胚胎乳腺上皮标志在小鼠Brca1 - / - 肿瘤和人类基底样乳腺癌中被激活。一些与祖细胞/干细胞功能调节相关的胚胎基因组成的小型调控网络，也在癌细胞中激活。该调控网络中的一个基因，SOX11，在正常出生后的乳房中未检测到，但在基底样和HER2+乳腺癌中高度表达。已知SOX11能够促进组织重塑、祖细胞扩增和许多细胞类型（包括神经祖细胞）的分化。SOX11在胚胎干细胞和胚胎肾细胞中的诱导表达导致调控发育过程（包括器官发生）相关基因的启动。因此，在浸润性乳房病变或浸润性乳腺癌中SOX11的表达可能因此提示这种癌组织含有一类特殊的细胞，该细胞具有与胚胎乳房祖细胞相关的典型特征，并且生长模式不同于成熟的出生后的乳房细胞。
　　导管原位癌（DCIS）呈现出这样的临床问题：它可能存在潜在的过度治疗或治疗不足的风险，且缺少生物标志物来识别那些可能继续恶化而需要更积极治疗的DCIS病变。已经发现SOX11在包括DCIS在内的浸润前期损伤中高度表达。在与乳腺癌相关的非典型性导管增生（ADH）而不是与癌症无关的ADH中检测到了较高水平的SOX11。因此，SOX11可能是介导DCIS进展的重要因素。在此，作者分析了成熟乳房细胞MCF10A和导管原位癌细胞DCIS.com（来自MCF10A进展系）中上调SOX11表达的作用。
　　结果：
　　SOX11水平对出生后乳腺祖细胞谱的影响
　　作为胚胎期乳腺细胞的标志，作者确认它不表达在成熟的乳腺组织中（图1A）。而在三阴性（ER、PR、HER2均为阴性）和HER2+乳腺癌细胞系中能够检测到SOX11的表达（图1B）。在DCIS.com或MCF10A细胞中作者没有检测到SOX11的表达——这两种ER-细胞系常被分别用来研究DCIS和正常出生后MEC细胞的生长（图1B）。为了研究SOX11在正常MEC细胞中的表达所产生的效应，作者将SOX11稳转到MCF10A细胞中（图1C），并且能够在细胞核中发现过表达的SOX11（图1D）。CD49f和EpCAM的表达区分了人乳房上皮细胞中的两种不同的亚群。EpCAM和CD49f的流式细胞术分析也能鉴定非致癌基底细胞系中的细胞亚群。MCF10A细胞显示出异质性，包含两个独立的亚群（图1E）：EpCAM + / CD49f +和EpCAM- / CD49f +。与MCF10A对照细胞（11.38±7.69％）相比，在MCF10A-SOX11细胞中观察到EpCAM- / CD49f +基底样群体的增高（27.44±14.58％）（图1E）。 ALDH活性在EpCAM- / CD49f +基底样MCF10A-SOX11细胞中比在MCF10A对照细胞中高1.76倍，表明了干细胞相关亚群的扩增（图1F）。在MCF10-SOX11细胞中检测到EpCAM-/CD49f +/ALDH +细胞亚群比例比MCF10A-对照细胞中高4.26倍。

图1.SOX11在出生后乳腺上皮细胞中的表达能够改变其祖细胞亚群

　　SOX11表达对出生后MEC生长、形态发生和克隆形成的影响
　　作者发现，与MCF10A对照细胞相比，MCF10A-SOX11细胞生长能力轻微但显着降低（图2A）。在多种培养条件下，与生长的MCF10A对照组相比，MCF10A-SOX11形成的微球体能够观察到形态学差异。与对照相比，MCF10A-SOX11微球体显得更致密和坚实（图2B）。这些效应与作者根据临床证据所猜测的SOX11对MEC的生长调控作用相一致。与MCF10A对照细胞相比，MCF10A-SOX11细胞单克隆形成能力不强，但能形成更多具有基底/肌上皮形态的克隆（图2C，D）。MCF10A-SOX11细胞具有更高的微球形成能力并且与MCF10A对照组形成的表型也不同（图2C，D）。与MCF10A对照相比，MCF10A-SOX11微球体中的CC3（Cleaved Caspase 3）水平略微降低（图2E）。

图2.SOX11的表达对出生后乳腺上皮细胞生长、形态发生和克隆形成的影响

　　SOX11水平对DCIS的影响
　　DCIS.com细胞系是一种模拟DCIS形成及其向浸润性疾病发展的细胞模型。作者将SOX11稳转到该细胞中，来研究SOX11在DCIS中的作用。DCIS-SOX11微球体在形成时（第0天）在形态上与DCIS对照球体相似，但在14天后表现出轻微的体积减少（图3A）。与对照相比，DCIS-SOX11细胞的生长能力稍微降低（图3B）。作者将CC3水平作为评价微球体出现紧凑和坏死表型的指标。作者在DCIS-SOX11微球体中检测到比在DCIS对照微球体中更低水平的Caspase 3活性（图3C，D）。通过FACS分析，作者在DCIS-SOX11细胞群中检测到比对照中高两倍的ALDH活性（图3E）。在DCIS-SOX11细胞中CD44 +/ CD24-亚群增加了1.5倍（图3F）。与对照细胞相比，在DCIS-SOX11细胞中检测到CD44 +/ CD24-/ALDH+细胞亚群增加7.7倍，CD44+/CD24+/ALDH+细胞亚群未检测到显着变化（图3G）。在DCIS-SOX11细胞中检测到的EpCAM-/CD49f+/ALDH+细胞亚群高于对照（图3H）。

图3.SOX11的表达对DCIS细胞的影响

　　SOX11在体外促进DCIS细胞的浸润性生长
　　通过Transwell分析发现，与对照细胞相比，DCIS-SOX11细胞对基质胶的穿透能力更强。三维浸润实验的结果显示SOX11增加了DCIS微球体的浸润能力（图4A，B）。最近的研究表明，PAM50测试中某个基因引起的黑素瘤抑制蛋白（MIA）在基底样乳腺癌中特征性地增高，并且在乳腺癌细胞中，由小干扰RNA介导的SOX11敲低时，MIA活性也显著降低。MIA由恶性转化后的黑色素瘤细胞分泌，在黑色素瘤的进展和浸润中起关键作用。作者检测MIA水平发现，DCIS-SOX11细胞比DCIS对照细胞的MIA水平高4倍。 MCF10A对照细胞和MCF10A-SOX11细胞检测不到MIA表达。这些结果表明，当SOX11在成熟的ER-/PR-/HER2-乳腺细胞中表达时，可以导致深刻的表型变化，但浸润性表型的获得还依赖于细胞环境因素。
　　SOX11在体内促进DCIS细胞的生长和进展
　　作者采用由Behbod等开发的小鼠乳腺导管内注射（MIND）模型，将DCIS对照和DCIS-SOX11细胞注射到雌性小鼠的乳腺导管中。 6-7周后收集乳腺，并对其中的一部分进行切片。注射DCIS对照细胞的小鼠乳腺可以发现原位病变和一些微小浸润（图4C）。注射DCIS-SOX11细胞的小鼠乳腺具有广泛的微小浸润和浸润灶（图4D）。活体成像显示，在异种移植后6-7周，在注射DCIS-SOX11细胞的小鼠乳腺中作者检测到更多的生物发光（图4E）。在异种移植后12周，作者收集了同一批小鼠的乳腺发现，注射DCIS对照细胞和DCIS-SOX11细胞均形成侵袭性肿瘤，在DCIS-SOX11肿瘤中观察到明显更多的生物发光，并且比DCIS对照细胞形成的肿瘤体积更大。对初期阶段（注射后6-7周）的病变乳腺进行RNA测序显示，细胞外基质（ECM）组分和细胞形状调节相关基因的RNA表达失调，并且编码与细胞生长相关的细胞因子和多肽的基因表达增加（表1）。将DCIS细胞注入乳腺导管12周后产生的侵袭性肿瘤的RNA测序显示，编码信号肽、ECM组分和胚胎器官形态发生调节相关基因表达增加（表2）。作者还将DCIS对照细胞和DCIS-SOX11细胞直接注射到雌性小鼠的乳房脂肪垫中。 IVIS显像显示注射细胞6周后，DCIS-SOX11细胞具有更多的生物发光和更大的肿瘤体积。在乳腺脂肪垫注射DCIS-SOX11细胞后形成的侵袭性肿瘤表现出与器官发生和发育过程相关基因的表达升高，具有与导管内注射相似的基因表达谱。作者鉴定了DCIS中与SOX11信号转导相关的候选效应因子，包括与乳腺癌有联系的ALDH1A1和HORMAD1。 ALDH1是正常和恶性人乳腺干细胞的标志物，并且是临床预后不良的指标。其中ALDH1A1亚型是癌症干细胞标志物，与临床预后不良有关。HORMAD1表达增高能够抑制RAD51依赖性同源重组并启动其它DNA修复途径。定量聚合酶链式反应（qPCR）分析显示DCIS-SOX11肿瘤中的SOX11、FHAD1、HORMAD1和TFAP2B表达比DCIS对照肿瘤中的水平增高（图5A）。IHC染色发现，在导管内注射DCIS对照细胞和DCIS-SOX11细胞（图5B）6-7周后收集的早期病变中检测到ALDH1A1+细胞。在将DCIS对照细胞注射到乳房脂肪垫后形成的肿瘤中，在肿瘤内部检测到分散的ALDH1A1+细胞（图5C）。而在DCIS-SOX11细胞形成的肿瘤中，作者在肿瘤内部以及肿瘤周边检测到大量的ALDH1A1+细胞簇（图5C）。

图4. SOX11提高了DCIS细胞在体外实验中的侵袭活性，促进了DCIS细胞在体内的生长和进展

图5.在小鼠模型中鉴定SOX11信号传导的下游效应物

表1.导管内和脂肪垫注射DCIS对照和DCIS-SOX11细胞后形成肿瘤后（仅6周的样本），RNA测序鉴定潜在的SOX11下游靶标

表2.在导管内和脂肪垫注射DCIS-对照和DCIS-SOX11细胞之后形成肿瘤后（6周和12周总样本），RNA测序所鉴定的潜在的SOX11下游靶标

　　SOX11在进展为转移灶的乳腺癌和侵入性乳腺病变中表达
　　作者发现SOX11表达水平升高与淋巴结阴性乳腺癌患者的预后不良相关，疾病进展形成远处转移的可能性增加，总体生存率下降（图6A，B，Q1-Q4代表SOX11表达水平的增加）。在一小部分纯DCIS病例（13/22 例ER-、6/17 例HER2+ 、1/22例ER+以及4/6例混合病例中DCIS和侵袭的部分）中，ER- DCIS病变相比于ER+ DCIS病变能检测到更高水平的核SOX11表达（P = 0.0002）（图6C，D）。

图6.SOX11是一种胚胎期乳腺上皮标记物，它表征乳腺癌患者的临床预后不佳，并在乳腺浸润性病变中表达

　　讨论
　　作者研究了在正常乳腺细胞和DCIS细胞系（来自MCF10A进展系）中表达SOX11（一种胚胎期乳腺发育相关因子）所产生的效应。SOX11在MCF10A和DCIS.com细胞中表达并不显着。作者的研究结果表明，外源的SOX11表达能够在MCF10A细胞中显着改变其祖细胞特征，产生和成熟MECs不同的性状。 SOX11表达导致基底样细胞群体增高、人乳腺祖细胞标记物ALDH的活性在MCF10A细胞基底样亚群内也显着增加。这些发现表明，在成熟的MECs中，SOX11的表达增加了具有基底样和luminal样谱系特征的细胞亚群。大部分出生前乳房细胞表达小鼠和人乳房上皮细胞中基底细胞谱系和luminal细胞系相关的标志物。在MCF10-SOX11细胞中，基底样形态的克隆微球体形成能力有所提高，这与ALDH+正常乳腺细胞具有干细胞特性的理论相一致。与对照相比，MCF10A-SOX11细胞的生长能力发生轻微缺失，并且不具有侵袭性。 说明SOX11在正常出生后MECs中的表达改变了祖细胞特征和其形态的发生，但没有促进侵袭。
　　对导管内注射过表达SOX11的DCIS.com细胞后形成的病灶进行表达谱测序，鉴定出了在微浸润和浸润生长阶段表达的大量SOX11下游效应物，许多与干细胞生物学和胚胎发育过程有着重要的联系。ALDH1A1在正常乳腺乳腺祖细胞的增殖和分化中起重要作用， ALDH1A1敲低后可导致克隆形成减少。 TFAP2B被认为能够刺激细胞增殖并抑制胚胎发育期间特定细胞类型的终末分化。 TFAP2B突变则引起Char综合征，这是一种以心脏、颅面和肢体发育缺陷为特征的疾病。 癌/睾丸基因由生殖细胞表达，在体细胞中处于静息状态，但在各种癌症中被激活，其中CT46 HORMAD1是一种减数分裂基因，是三阴乳腺癌同源重组缺陷的驱动因子。
　　DCIS-SOX11细胞形成的病灶中，发现许多上调的基因编码ECM组分或ECM调节因子，包括信号肽和分泌型生长因子。 ECM在癌症中被高度修饰，并且可以促进原发性肿瘤或转移性肿瘤的发展。SOX11可能通过产生ECM裂解产物（包括具有潜在信号传导功能的信号肽和局部释放的生长因子）而促成DCIS.com细胞浸润性表型的增多。综上所述，作者的研究结果表明，乳腺癌病灶中SOX11的表达能够改变祖细胞/干细胞群体、促进组织重塑并产生浸润倾向。
　　SOX11在许多其他癌症中表达，包括神经胶质瘤、肺癌、套细胞淋巴瘤（MCL）、卵巢癌和前列腺癌。SOX11在大多数侵袭性MCL中异常表达，被认为是MCL中可靠的病理学标志物。SOX11在基底样和HER2+乳腺癌中表达最高，但是还需要进一步的研究来评估它是否能够成为临床上有价值的标志物。
　　作者的研究结果表明过表达SOX11对MCF10A系列乳腺细胞的影响是依赖于细胞环境的。 外源表达SOX11的DCIS.com细胞，浸润性生长显着增加，但是在MCF10A-SOX11细胞中却没有这些效应。 DCIS.com细胞是由H-Ras转化的MCF10A细胞克隆衍生的。因此似乎证明，如果没有表达诸如HRAS这类恶性驱动因子，SOX11将不会促进浸润性生长。 作者鉴定了在非恶性MCF10A细胞向恶性DCIS.com细胞转化期间三种可能的恶性驱动突变（EPHA7，MAP3K12和PCSK5），它们也可能参与构筑SOX11相关性浸润生长的细胞环境。
　　最近对DCIS和早期浸润性乳腺癌的分子研究发现，在纯DCIS和浸润性肿瘤标本中，SOX11具有高表达水平。SOX11高水平表达主要在基底样和HER2+标本中检测到。DCIS有一种亚型，其表达一组与进展期肿瘤相似的基因。SOX11常常与这些恶性基因共表达。对这些基因的功能注释显示，在该DCIS亚型中，这些基因与发育过程和器官形态发生有密切关系。使用DCIS.com细胞的体外和体内研究显示，SOX11能够促进细胞存活和DCIS细胞的浸润，并且增加了ALDH+群体的大小，包括CD44+/CD24-/ALDH+亚群。 CD44+/CD24-/ALDH+表型常被认为能够增加乳腺癌细胞的致瘤性。总的来说，这些发现支持了这样的观点：SOX11在DCIS病灶中的表达使其更具侵袭性，并能使其进展为浸润性乳腺癌。
　　通过IHC检测发现，在ER-DCIS病例中59％是SOX11+。高水平的SOX11表达与乳腺癌患者的整体生存率较差相关，而淋巴结阴性患者中，高水平SOX11也预示着较差的预后——通常这一组患者预后良好。但是，用于生存分析的数据集不能代表DCIS。为了确定DCIS中的SOX11过表达是否与发展为浸润性乳腺癌的风险相关，需要分析大量长期随访的纯DCIS样品。Sloane是全英国筛查DCIS的前瞻性审计项目（www.sloaneproject.co.uk）。LORIS是英国的一项III期临床试验项目，它对比了低风险DCIS的手术治疗和长期主动监控。这两项计划将评估SOX11的临床价值，以及其与DCIS进展为浸润性乳腺癌的相关性。
　　作者将SOX11的表达与DCIS细胞发展为浸润性生长相联系，在DCIS中鉴定了SOX11的潜在下游效应因子，增加了新的生物学信息，这可能有助于更好地理解SOX11阳性乳腺病变患者的病理学特征，进而选择适合的治疗手段。 SOX11是ER- DCIS潜在的生物标志物，它的表达可能意味着更高的恶化风险。 需要进一步的研究来确定SOX11+ DCIS患者是否更可能发展成浸润性肿瘤。