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铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞自噬的细胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 方式，依赖于铁介导的氧化损伤，铁积累的增加，自由基的产生，脂肪酸供应与脂质过氧化物增加是诱导铁死亡的关键。
铁死亡的调控机制
关于铁死亡的调控，主要受 GSH/GPX4 途径的调节；铁代谢以及脂质代谢的相关通路也发挥着重要作用。
图 1. GPX4 相关信号通路[1] System Xc- 是一种广泛分布在磷脂双分子层中的重要的抗氧化体系，由两个亚基 SLC7A11 和 SLC3A2 组成的异二聚体。胱氨酸和谷氨酸通过 Xc-系统 以 1:1 的比例进出细胞交换，被吸收的胱氨酸 (Cystine) 在细胞中被还原为半胱氨酸 (Cysteine)，并参与 GSH 的合成。
GPX4 是催化哺乳动物细胞中磷脂氢过氧化物 (PLOOH) 还原的主要酶。GPX4 将谷胱甘肽 (GSH) 转化为氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并将细胞毒性脂质过氧化物 (PL-OOH) 还原为相应的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可导致脂质过氧化物的积累。GPX4 表达下调的细胞对铁死亡更敏感，而 GPX4 表达上调则抑制铁死亡。GSH 在谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 的作用下减少 ROS 和活性氮。
此外，甲羟戊酸 (MVA) 途径通过调节硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟来影响 GPX4 的合成，从而调节铁死亡的发生。
小贴士： Erastin 作为最经典的铁死亡诱导剂，可抑制胱氨酸输入，影响 GSH 的合成，导致 GPX 活性降低，细胞抗氧化能力下降，脂质 ROS 积累， 最终发生氧化损伤和铁死亡。
常用的铁死亡诱导剂 RSL3 直接作用于 GPX4 并抑制其活性，从而降低细胞的抗氧化能力并积累 ROS，导致铁死亡。
图 2. 脂代谢与铁死亡相关通路[2]
铁依赖性脂质 ROS 积累与所有途径的铁死亡有关。不受限制的脂质过氧化是铁死亡的标志。 游离多不饱和脂肪酸是合成脂质信号转导介质的底物，但它们必须被酯化成膜磷脂并被氧化才能传递铁死亡信号。脂氧合酶 (LOX) 和细胞色素 P450 氧化还原酶 (POR) 通过脂质的双氧合启动脂质过氧化。研究表明，Phosphatidyl ethanolamine 是诱导细胞铁死亡的关键磷脂。酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (LPCAT3) 参与Phosphatidyl ethanolamine 的生物合成和重构，激活多不饱和脂肪酸并影响其跨膜特性。 因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表达可减少细胞内脂质过氧化物底物的积累，从而抑制铁死亡。
铁积累 (如增加铁吸收、减少铁储存和限制铁外流)可以促进铁死亡 (具体可见: 铁死亡是什么，如何检测？您要的“一文通”来了！)。过量的铁通过至少两种机制促进随后的脂质过氧化：通过铁依赖性 Fenton 反应产生活性氧 (ROS) 以及激活含铁酶。
铁死亡如何检测呢？
铁死亡的关键指标铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化驱动的，因此在铁死亡期间检测这种脂质过氧化是必要的。此外，线粒体在铁死亡期间通常表现出萎缩、致密的形态（因此可以通过检测线粒体来判断铁死亡)。此外，检测特定的基因表达变化：例如铁死亡的细胞中 TfR1 的上调及其重定位于质膜。下面小 M 来给大家介绍几种常用的铁死亡检测方式~
铁死亡会导致细胞死亡。因此一般在铁死亡的研究中，检测细胞活力是常见方法，同时也会通过染色等方法来观察细胞膜通透性，线粒体形态等。 如在 Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制 Frataxin (FXN) 是否会促进铁死亡。用 Erastin 同时处理 FXN 敲低和对照细胞，12 小时后用 CCK8 法检测细胞活力，结果表明抑制 FXN 表达显著增强了 Erastin 诱导的细胞死亡。同时碘化丙啶 (PI) 和 CFDA-SE 染色结果以及用透射电镜观察到的线粒体碎裂、空泡化和嵴增大都表明 FXN 耗竭协同 Erastin 诱导铁死亡[3]。图 3. 抑制 FXN 对 Erastin 诱导的 HT-1080 细胞铁死亡的影响[3] A, 细胞暴露于不同浓度的 Erastin，检测细胞活力；B, Erastin 处理细胞 12 小时后用荧光显微镜观察 PI 阳性细胞；C, Erastin 培养细胞 3 天，用 CFDA-SE (5 μM) 染色，然后进行流式检测；D, 透射电子显微镜 (TEM) 检测线粒体的形态变化
细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平。例如，在研究氧化应激介导的视网膜色素上皮 (RPE) 变性的潜在机制时，通过用 FerroOrange 染色细胞 (亚铁离子探针)，结果表明 NaIO3 和 Erastin 处理的细胞积累了过多的亚铁离子，说明诱导了铁死亡，而 Fer-1 或 DFO 预孵育可以抑制亚铁离子的积累，如图 4 所示。结果表明铁死亡是氧化应激介导的 RPE 变性的主要病理过程[5]。
图 4. 通过 FerroOrange 染色评估亚铁离子水平[4]
ROS 和脂质 ROS 在铁死亡中起关键作用，文献报道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制体内的 ROS 水平。细胞内会由于铁的积累而抑制抗氧化系统，铁可能直接通过 Fenton 反应产生过量的 ROS，从而增加氧化损伤。因此 ROS 检测也是常用方法 (活性氧检测探针: ROS 探针大赛，你要的检测方法都在这里！)
Lin Li 在研究中发现羧基修饰的 (CPS) 可以增加细胞内 SOD 水平，因此推测 CPS 可能抑制铁死亡。实验结果表明，CPS 抑制了 RAW 264.7 中 Erastin 诱导的 ROS 升高 (图 5a, b)，并且比去铁胺具有更强的抗铁死亡作用 (图 5c, d)[5]。
图 5. CPS 有效抑制 RAW 264.7 细胞的铁死亡[5]
A-B, 在有无 CPS 条件下 Erastin 对 ROS 水平的影响；C-D, 在有无 CPS 或 DFO 条件下Erastin 对细胞活力的影响
除了 ROS 检测，铁死亡的脂质过氧化的指标还有谷胱甘肽 (GSH) 合成的变化、脂质过氧化物 (MDA, LPO) 水平的变化。
在遗传性血色素沉着症 (HH，一种铁超负荷疾病) 与铁死亡的关系研究中，为了证实铁死亡在 HH 相关肝损伤中的作用，作者用铁死亡抑制剂 Fer-1 治疗 Hjv–/– 小鼠 (经典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 样小鼠模型) 三周。如图 6 所示，与对照组小鼠相比，经 Fer-1 处理的小鼠肝脏 MDA 水平显著降低，NADPH 水平增加。此外，Fer-1 可以降低小鼠血清 ALT 水平胶原蛋白沉积。结果表明，铁超载会诱导 HH 小鼠的铁死亡[6]。 图 6. 铁死亡抑制剂 Fer-1 可减轻 HH 小鼠中铁过载引起的肝损伤[6] 用或不用 Fer-1 治疗的野生型、Hjv–/–、Smad4Flox/flox 和 Smad4Alb/Alb 小鼠中, A, 肝脏 MDA 含量；B, 肝脏 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝脏 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平
在 DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase 一文中，作者探究了 DJ-1 负调节铁死亡的机制。研究发现，用 RNA 干扰抑制 DJ-1 表达可以与 Erastin 协同抑制细胞内 GSH 水平 (图 7A)。同时，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆转 Erastin 诱导的脂质 ROS 积累 (图 7B) 和细胞死亡 (图 7C)。因此，作者推测 DJ-1 可能会影响 GSH 的合成从而抑制铁死亡[7]。 图 7. DJ-1 通过抑制 GSH 水平负调节铁死亡[7] A, Erastin 处理DJ-1 KD H1299 细胞 6 h 后 GSH 水平； B, 在有无 GSH 或 NAC 条件下细胞用 Erastin 处理细胞 12 h 后脂质 ROS 水平；C, 用Erastin 处理细胞 36 h 后，测定细胞活力
总结： 铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，既包括铁稳态的调节通路,更有铁代谢以及脂质代谢相关通路等。 但是各个通路相辅相成，互相影响。调控途径不同， 检测的指标也十分多样化，小伙伴们在实验过程中，检测方法可要多打 “组合拳”！
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参考文献 1. Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282. 2. Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296. 3. Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483. 4. Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971. 5. Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465. 6. Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792. 7. Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.
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