干货分享 | 脂滴？细胞器？-MedChemExpress

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脂滴的结构

脂滴 (Lipid droplets, LDs) 是一种呈球状的细胞器，也称为脂质体或油体。与其他细胞器不同，脂滴的表面是单层的磷脂膜，在哺乳动物细胞中，脂滴单分子膜的主要成分是磷脂酰胆碱 (Phosphatidylcholine, PC)，高达60%，其次是磷脂酰、磷脂酰肌醇等[1] 。在磷脂膜上有超过 200 种不同的结构蛋白和功能蛋白定位于 LDs 的表面，如 DGAT2、Rab18、脂滴包被蛋白 (Perilipin) 和 CCT 等，调节 LD 内稳态和细胞内相互作用[2,3] 。脂滴的核心是中性脂质，如三酰甘油酯 (Triacylglycerols, TAG) 和甾醇酯 (Sterol esters, SE) 等，沉积在脂滴中，在白色脂肪细胞中，TAG 主要以脂类酯的形式储存在脂滴中，而在类固醇细胞中，SE 是主要成分，此外，根据细胞类型的不同，许多其他内源性中性脂质如视黄醇酯、醚脂质和游离胆固醇也储存在脂滴核内[4] 。

图 1. 脂滴的结构特征[4]

脂滴的生物发生

由于脂滴特殊的亲水/疏水两性结构，科学家对其的产生一直在不断的进行中，目前广泛认为，在原核生物中，中性脂质的积累是在质膜的特定脂质结构域开始的，最后形成了细胞质脂滴。在真核生物中，脂滴发生于内质网中的磷脂双分子层的小叶内，内质网双分子层之间累积的中性脂的体积增加超过了溶解度的极限，脂滴即从内质网双分子层中被油化出来[5,6] 。

图 2. 原核生物和真核生物中脂体形成的模型[6]

在原核生物中，中性脂质体的形成始于 WS/DGAT 附着在细胞质膜上，随后合成小脂滴，形成被单层 PLs 包裹的产油层。脂质体前体由 SLD 聚集和融合形成，形成膜结合的脂质体前体，然后形成细胞质脂质体。真核生物的油体是由内质网膜的两个小叶之间的脂质渐进式积累形成的，并可能有结构蛋白的共翻译插入，从而形成出芽的油体并释放到细胞质中。

脂滴的功能

许多生物在细胞中储存脂质以产生代谢能量，以防能量来源不足。但脂滴不是简单的脂质储存库，而是具有多种细胞功能的复杂细胞器[7] 。除了在能量代谢中发挥作用外，脂滴也是细胞内和细胞间脂肪酸运输的重要节点，还在各种细胞事件中发挥作用，如蛋白质降解、隔离转录因子和染色质成分以及为某些核受体生成脂质配体[8] 。此外，病毒核衣壳蛋白核心本身可与脂滴表面结合并协调病毒感染的持续传播[9] 。

脂滴相关检测

由于脂滴功能的多样性，其异常与许多病理状态相[10] 。因此，了解脂滴的生物学特性和功能便尤为重要。下面小 M 就来为大家介绍一下脂滴常用的染料检测。

■ 油红 O (Oil Red O) 染色
脂质代谢改变和肾脏内的过度脂质沉积被认为是肾脏疾病进展的重要有害因素，据报道，自噬可通过诱导脂质分解和促进脂滴形成的双向机制参与脂代谢调控。
Beclin-1 是自噬体的标记物，为验证 Beclin-1 与纤维化肾小管上皮细胞 (Tubular epithelial cells, TECs) 自噬诱导的脂质积累是否有关，通过 Oil Red O 染色观察在TGF-β1(可引起自噬激活和脂质积累) 刺激下，Beclin-1 敲低的 HK-2 细胞中脂质沉积。结果显示，TGF-β1 刺激下，Ctrl siRNA 转染的 HK-2 细胞的脂质水平升高，但在 Beclin-1 敲除的 HK-2 细胞中脂质水平不显著 (图 3)。以上表明，Beclin-1 参与了自噬诱导的 LDs 在肾纤维化的 TECs 中的积累。

图 3. 油红 O 染色细胞的图像处理[11]

油红O (Oil Red O) 染色是一种简单的定性方法，当油红 O 与脂滴接触时,会直接进入细胞/组织内脂质中，使其染为红色。
步骤(参考)：1. 将肾组织或细胞玻片的冰冻切片在 PBS 中洗涤，多聚甲醛固定 30 min。2. 样品在 60% 异丙醇中孵育 3 min，然后用新鲜制备的 60% 油红 O  染色 30 min, 60% 异丙醇染色 1 min，用 PBS 洗涤。3. 样本用苏复染。切片使用显微镜进行可视化。4. 使用 Image J 软件按照标准程序对脂滴数量和大小进行定量。


■ 尼罗红(Nile Red) 染色
除油红 O 染色以外，Nile Red 也是一种常用的荧光探针，能够定位及定量细胞内的脂质。如，在研究未羧化骨钙素 (Uncarboxylated osteocalcin, GluOC) 对肝细胞作用的机制时，以油酸/棕榈酸 (Oleic acid/Palmitic acid, OA/PA) 诱导的细胞作为非酒精性脂肪性肝病细胞模型，通过 Nile Red 染色检测三酰甘油水平。结果显示，GluOC 降低了甘油三酯水平。表明 GluOC 抑制了 OA/PA 诱导的 NCTC 1469 细胞中的脂质积累。

图 4. Nile Red 染色染色来监测 GluOC 处理后的细胞内脂滴[12]

Nile Red 又叫尼罗红，是一种亲脂性的恶嗪类荧光探针，在水中和其他极性溶液中不发荧光，在非极性溶剂中出现明亮的红色荧光，能够定位及定量细胞内的脂质。
步骤 (参考)：1. PBS 洗涤样本 3 次， 4% 多聚甲醛固定 15 min，然后用 0.5% Triton X-100 处理 15 min。2. 用 Nile Red 工作液在室温下染色 60 分钟。3. 染色结束，去除多余的染料，用 PBS 洗涤细胞 3 次。4. 使用光学显微镜拍摄照片。


■ BODIPY 脂滴类染料
此外，BODIPY 类染料也是脂滴标记的染料，最大特点是其非对称性，可以很好的连接标记基团 (比如亲脂类结构)，穿过细胞膜进入细胞内部，通过在细胞内的极性脂类上定位以进行特异性染色。BODIPY 类染料可用于标记活细胞和固定细胞，还可用于光动力学疗法的研究。
如，研究设计成熟的脂肪细胞 (Apo) 包裹棕榈酸结合的雷公藤甲素衍生物 (pTP) 和光敏剂 Ce6 (pTP-Ce6-Apo)，用于黑色素瘤的光动力学治疗。为探讨 pTP-Ce6-Apo 能否将脂肪细胞内的脂滴转运到 A375 细胞内，以及 pTP-Ce6-Apo 能否释放 Ce6 并被 A375 细胞摄取，使用 BODIPY 505/515 染色 pTP-Ce6-Apo。结果显示 A375 细胞周围分布着少量的脂滴，表明 A375 细胞可以从脂肪细胞中摄取脂滴并为自己所用。同时，A375 细胞核周围有少量红色荧光为 Ce6，表明 Ce6 从 pTP-Ce6-Apo 中成功释放并被 A375 细胞摄取。

图 5. pTP-Ce6-Apo的脂滴和Ce6与A375细胞核共定位[13]

BODIPY，也叫硼，BDP，是以硼二 (boron-dipyrromethene) 为荧光结构母核的染料。其对环境的极性和 pH 值相对不敏感，因此，在不同生理条件下相对稳定。
步骤 (参考)：1. 将 BODIPY 标记的 pTP-Ce6-Apo 置于 Transwel l小室上层，A375 细胞玻片置于底层。共培养后，取出 A375 细胞片。2. 用多聚甲醛固定，避光后染色。3. 在激光共聚焦显微镜下观察制备的 A375 细胞片。
下面是小 M 为大家整的一些 Bodipy 类相关染料，方便大家更好地进行脂质代谢相关研究~

表 1. Bodipy 类相关脂滴染料

Product Name	Ex/Em (nm)
BODIPY 493/503 methyl bromide	493/503
BODIPY 493/503	493/503
BODIPY 505/515	505/515
BODIPY 500/510 C1, C12	500/510
BODIPY FL C12	480/508
BODIPY 558/568 C12	558/568

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参考文献
[1] Schaffer, J. E. Lipotoxicity: when tissues overeat. Curr. Opin. Lipidol. 14, 281–287 (2003).
[2] Fawcett, D. W. An Atlas of Fine Structure: The Cell, Its Organelles, and Inclusions (Saunders, 1966).
[3] Farese RV Jr, et al. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 2009 Nov 25;139(5):855-60.
[4] Farese, R. V. & Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell 139, 855–860 (2009).
[5] Sorger, D., Athenstaedt, K., Hrastnik, C. & Daum, G. A yeast strain lacking lipid particles bears a defect in ergosterol formation. J. Biol. Chem. 279, 31190–31196 (2004).
[6] Wältermann M, et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: how bacteria fatten up. Mol Microbiol. 2005;55(3):750-763.
[7] Zehmer JK, et al. A role for lipid droplets in inter-membrane lipid traffic. Proteomics. 2009;9(4):914-921.
[8]  Welte MA. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 2015;25(11):R470-R481.
[9] Herker E, et al. Unique ties between hepatitis C virus replication and intracellular lipids. Trends Endocrinol Metab. 2011;22(6):241-248.
[10] Krahmer N,et al. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Mol Med. 2013;5(7):973-983.
[11] Yan Q, et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis [published correction appears in Cell Death Discov. 2019 Jul 10;5:116]. Cell Death Discov. 2018;4:2. Published 2018 Jun 27.
[12] Wang, D.; Zhang, M.; Xu, J.; Yang, J. Uncarboxylated Osteocalcin Decreases SCD1 by Activating AMPK to Alleviate Hepatocyte Lipid Accumulation. Molecules 2023, 28, 3121.  
[13] Yan Q, et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis [published correction appears in Cell Death Discov. 2019 Jul 10;5:116]. Cell Death Discov. 2018;4:2. Published 2018 Jun 27.