(1) 利用基因捕获方法 (Gene trap) 和体外胚胎干细胞的选择，确定了参与核仁神经发生相关基因调控的新基因--Midnolin。
(2) Midnolin 编码一种含有 508 个氨基酸 (aa) 的蛋白质，其中包含一个泛素样结构域。
(3) 利用 Midnolin-绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白研究 Midnolin 在细胞内的分布 。Midnolin 被发现定位于细胞核和核仁，但不在细胞质中。核仁定位信号 (NLS) 为位于 Midnolin C 端区域的包含 28 个氨基酸的肽 (440-QQKRLRRKARRDARGPYHWTPSRKAGRS-467)。
▐ Midnolin 是 IEG 蛋白质降解的调节剂
为了研究 IEGs 蛋白质降解的机制，作者重点研究了两种常见的来自不同蛋白家族的转录因子——EGR1 和 Fos。通过构建稳定表达 EGR1 或 FosB GPS (The global protein stability) 报告基因的 HEK-293T 细胞系，并进行了全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，发现 MIDN 是负调节 EGR1 和 FosB 稳定性的热点基因。并发现敲除 MIDN 基因会增加 EGR1 和 FosB 稳定性。
图 3. Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的调节剂，可促进多种 IEG 蛋白的降解[2]。
A-C：遗传学筛选显示 Midnolin 是 IEGs 蛋白降解的调节。(A) 构建稳定表达 EGR1 或 FosB GPS 报告基因的 HEK-293T 细胞系并进行全基因组 CRISPR-Cas9 筛选示意图。(B-C) 遗传筛选结果，显示 MIDN 是负调节 EGR1 和 FosB 稳定性的热点基因。D-G：Midnolin促进生理环境中多种 IEG 蛋白的降解。(D-E) NIH/3T3 细胞中敲除/过表达 Midnolin 对 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影响; (F-G) 初级皮层神经元中敲除/过表达 Midnolin 对 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1 蛋白水平的影响。
此外，在 NIH/3T3 成纤维细胞 (图 3D-E) 和初级皮层神经元 (图 3F-G) 中过表达 Midnolin 降低了多种 IGEs 蛋白水平，如 EGR1、FosB、c-Fos 和 NR4A1，且敲除 Midnolin 结果与之相反。上述结果表明这些 IEGs 蛋白可能都通过 Midnolin 发生靶向降解。进一步研究显示，Midnolin 可能还参与了细胞核内除 Fos 和 EGR1 外数百种其他转录因子的降解。
Midnolin 途径如何降解非泛素化蛋白？
▐ Midnolin 通过与其底物和 26S 蛋白酶体结合而降解非泛素化蛋白
作者将内源性 Midnolin 用 3xHA 标记，进行质谱分析发现 Midnolin 可免疫共沉淀 19 S 调节颗粒和 20 S 核心颗粒体 (图 4A)。同时，使用 MG132 (蛋白酶体抑制剂) 抑制底物蛋白的降解，发现 Midnolin 与底物 c-Fos、FosB、EGR1 存在相互作用，且与 PSMD2 和 PSMA2(分别为 19 S 和 20 S 蛋白酶体的组成部分) 存在相互作用 (图 4B)。图 4. Midnolin 与 26S 蛋白酶体结合，促进结合底物不依赖于泛素化的降解[2]。
(A) 将 3xHA 标签引入 HEK-293T 细胞中内源性 Midnolin 的 N 末端。细胞用 MG132 处理 6 小时后进行 3xHA-Midnolin 免疫沉淀，并进行质谱分析。(B) Midnolin 免疫共沉淀蛋白酶体和 内源 IEGs 蛋白。PMA: PKC 激动剂，诱导 IEGs 的转录。(C) 内源性 Midnolin 水平因抑制蛋白酶体而显着增加，但不会因抑制泛素 E1 而增加。
此外，MG132 可增加 Midnolin 蛋白水平，但 TAK-243 (泛素 E1 酶抑制剂) 则不影响 Midnolin 蛋白水平 (图 4C)，且 TAK-243 并不影响 Midnolin 对底物蛋白的降解，由此证明Midnolin 降解蛋白不依赖于泛素化。
注：26S 蛋白酶体由中间一个圆柱形 20S 核心颗粒和两端覆盖的一个或两个 19S 调节颗粒组成。
▐ Midnolin 含三个协同作用的结构域，促进结合底物的蛋白酶体降解
作者通过使用人工智能平台 AlphaFold 进行结构预测，显示 Midnolin 蛋白包含三个稳定的结构域: 位于 N 末端的泛素样结构域 (Ubl)、含两部分假对称 (pseudosymmetric) 的“捕获 Catch”结构域、和一个位于 C 末端的长 α 螺旋 (α Helix-C) (图 5A)。
接下来，作者使用免疫共沉淀实验以确定 Midnolin 与底物和/或蛋白酶体相互作用所需的结构域。结果显示，Ubl 结构域的点突变/缺失/诱变对 Midnolin 与EGR1 或蛋白酶体的相互作用无影响，但 Catch 结构域的缺失使得底物蛋白 (如 EGR1) 无法被沉淀下来 (图 5C 左)，α Helix-C 或 NLS 结构域的缺失使得蛋白酶体 (如 PSMD2) 无法被捕获 (图 5C 右)。图 5. Midnolin 包含三个结构域，它们协同作用以促进底物的蛋白酶体降解[2]。
(A) AlphaFold 预测的 Midnolin 结构; (B) 引入 Midnolin cDNA 的突变或截短的示意图; (C) 使用 CMV 启动子对 HEK-293T 细胞稳定表达 2XFlag Midnolin，用 10 μM MG132 处理细胞 6 小时，并进行免疫印迹。
也就是说，Midnolin 通过 Catch 结构域与目标蛋白相互作用，通过 α Helix-C 结构域与 26S 蛋白酶体结合。同时，Midnolin 可通过其 Catch 结构域结合底物内的非结构化区域 (unstructured regions)，并形成 β 链。虽然 Midnolin-蛋白酶体途径可绕过泛素化系统来实现许多核蛋白的选择性降解，但关于如何实现特异性的靶蛋白降解还有待深入研究。
本期小 M 带大家回顾了经典的泛素化蛋白质降解过程，并介绍了一种全新蛋白降解机制 —— Midnolin-蛋白酶体途径，该途径可绕过泛素化系统来实现许多核蛋白的选择性降解。小 M 相信，基于 Midnolin 的新型靶向蛋白降解类药物将会被逐渐开发出来，用于神经或精神疾病，癌症等疾病的研究~
MG132
蛋白酶体抑制剂 (IC50: 100 nM)，可诱导凋亡和自噬。
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TAK-243
泛素 E1 酶 (UBA1) 抑制剂，抑制蛋白泛素化。
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PMA
PKC 和 SphK 激活剂，可诱导 IEGs 的转录。
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泛素化化合物库
200+ 活性化合物，用于泛素化及相关疾病研究。
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参考文献：
[1] Tai HC, et al. Ubiquitin, the proteasome and protein degradation in neuronal function and dysfunction. Nat Rev Neurosci. 2008 Nov;9(11):826-38.
[2] Gu X, et al. The midnolin-proteasome pathway catches proteins for ubiquitination-independent degradation. Science. 2023 Aug 25;381(6660):eadh5021.
[3] Obara Y, et al. Midnolin is a novel regulator of parkin expression and is associated with Parkinson's Disease. Sci Rep. 2017 Jul 19;7(1):5885.
[4] Tsukahara M, et al. Novel nucleolar protein, midnolin, is expressed in the mesencephalon during mouse development. Gene. 2000 Aug 22;254(1-2):45-55. 
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