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本帖最后由 BLZJ_7d91db 于 2024-7-23 10:01 编辑
RNA 干扰技术是研究基因功能的一种强大工具，这种技术有可能直接从源头上让致病基因“沉默”。今天就让我们一起来学习如何做 RNA 干扰实验！
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是指一种高度保守的细胞机制，其中Argonaute (Ago) 家族蛋白结合小 RNA，通过小 RNA 和靶 RNA 之间的序列互补性触发较长 RNA (即靶 RNA) 的降解。RNAi 机制首次由 Andrew Z. Fire、Craig C. Mello 及其同事在线虫 (Caenorhabditis elegans) 中描述，也因此获得了 2006 年诺贝尔生理学或医学奖。图 1. 2006 年诺贝尔生理学或医学奖授予了 RNAi 机制的发现者[1]。
自发现以来，RNAi 已迅速发展成为一种强大的反向遗传学工具，用于在细胞和生物体水平上研究基因功能、调控和相互作用。在昆虫和其他动物中，已知有三类不同的小 RNA 可触发三条相应的 RNAi 途径：siRNAs、miRNAs 以及 piRNAs。
本期小 M 为大家介绍 siRNA 干扰途径！
siRNA 是一种小的双链 RNA (dsRNA)，约有 20-25 个核苷酸长度，可以触发 RNA 干扰机制。长双链 RNA 在被 Dcr2 与 R2D2 或 Loqs 切割成短双链 RNA。短双链 RNA 解旋后正义链被降解。图 2. siRNA 诱导的 RNA 干扰机制[2]。
反义链与多种蛋白组分 (如 Ago2) 形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)。RISC 中保留的反义链与靶基因的 mRNA 特异地互补，同时 RISC 具有核酸酶活性，能将靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表达。
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设计 siRNA
如果您希望设计自己的 siRNA，可根据以下原则来设计 siRNA[3][4][5]。然后，通过化学合成、体外转录、载体或 PCR 产物表达等方式进行制备相应的 siRNA。
一些在线网站可以基于一定规则设计出 siRNA 序列。如，http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html；
http://sidirect2.rnai.jp/。
设计规则如下：
(1) 从靶基因转录本 (mRNA) 的 AUG 起始密码子开始，寻找“AA”及之后 3'端相邻的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶向位点。
(2) siRNA 序列的 GC 含量应为 30%-60% 左右。
(3) siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列。
(4) 避免针对 5'和 3'端的非编码区 (untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响沉默复合体结合 mRNA， 进而影响 siRNA 的效果。
(5) 将潜在的靶向位点与相应的基因组数据库 (人、小鼠、大鼠等) 进行对比，如果靶向序列与其他基因编码序列具有超过 16-17 个连续碱基对同源性，就不能选择这样的序列。我们建议使用 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
(6) 随机设计的 siRNA 存在降低靶向基因的 mRNA 水平效果不佳的可能性，所以一个基因需要设计多个靶基因的 siRNA，通过实验确认最有效的 siRNA 序列。2
siRNA 套装
为了满足广大研究者利用 RNA干扰的方法去探究基因功能的需求，MedChemExpress (MCE) 专门推出预设计 siRNA 套装。
我们的预设计 siRNA 套装针对靶基因 (仅限人、小鼠、大鼠) 的不同区域设计三对 siRNA，我们保证在标准使用条件下 (转染效率 80% 以上) 至少一对 siRNA 的 mRNA 水平沉默效率达 70% 以上。套装产品包括 3 对 siRNA，附赠阴性对照、阳性对照、FAM 标记阴性对照 siRNA。
Tips：- MCE 提供的 siRNA 为冻干粉形式，收到产品后，请于 -20℃ 或 -80℃ 保存，可以稳定保存一年。
- 使用前瞬时离心，用 RNase-free H2O 或灭菌 ddH2O 配制成 20 μM 储存液。
- 配置 20 μM 储存液需要向 5 nmol 的 siRNA 中加入 250 μL 灭菌水。
- 20 μM 储存液分装保存避免反复冻融。
- 荧光标记的 siRNA 需要避光保存。
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siRNA 转染
常见转染的方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE 葡聚糖和 polybrene、机械法 (例如，显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂，其中使用阳离子脂质体试剂转染是目前最常用的转染方法。
MCE 推出最新转染试剂 HY-K2017 (siRNA/miRNA Transfection Reagent)，可用于高效率转染 siRNA。对于一些难转染的细胞如原代细胞、干细胞和 B 细胞系，可以考虑选择电穿孔法。图 3. 转染实验示意图。
转染步骤如下：
1. 接种细胞：待达到合适的细胞密度时进行细胞转染。
2. 制备转染复合物：用无血清的培养基中稀释 siRNA 储存液和转染试剂 HY-K2017，然后混合两者，室温孵育 15-30 min。
3. 转染：向细胞中加入转染复合物和无血清培养基， 可在转染约 6 h 后将无血清培养基更换为正常含血清培养基，然后培养 24-96 h 后，收样检测。
4. siRNA 效果验证：常用方法是 RT-PCR 检测靶基因 mRNA 水平或 Western 检测靶基因蛋白表达水平。
MCE 的预设计 siRNA 套装针提供了阴性对照、GAPDH 阳性对照、FAM 标记阴性对照。阴性对照与目的基因的序列无同源性，可用于验证 siRNA 的特异性。图 4. 检测 siRNA 的转染效率[6]。 将 FAM 标记的 siRNA 转染 Vero 细胞。转染后第 1、2、3 天荧光显微镜检测 siRNA 的转染效率。
此外，客户可以通过检测转染了 FAM 标记阴性对照的细胞的荧光信号来确定转染效率 (图 3)。通过转染了 GAPDH 阳性对照的细胞确认转染实验中操作是否有问题。如果 GAPDH mRNA 表达降低，则证明转染实验中操作没有问题，GAPDH siRNA 正常发挥作用。如果 GAPDH mRNA 表达没有变化，则证明操作出现失误，转染失败。
▐ 1. 针对人类基因设计的 siRNA 对其他物种是否也有效？
一般 siRNA 都具有物种特异性，所以针对人类基因设计的 siRNA 沉默其他物种的同源序列的效果无法保证。如果希望 siRNA 能对两个或两个以上的物种有效，这需要进行相应的生物信息学分析。
▐ 2. 同样的 siRNA 为什么在细胞 A 中有效，在细胞 B 效果不好？
不同细胞可能转染效率不一样，基因表达水平也不一样，这些都与 siRNA 的作用效率有关。
▐ 3. 如何设计用于 RT-PCR 的引物？
RT-PCR 的引物应该设计在 siRNA 靶向位点的两侧，而不是同侧。设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果。
另外，RT-PCR 结果会因为靶基因 mRNA 降解时间不同、细胞内靶基因 mRNA 丰度不同而导致假阴性结果，推荐使用多种检测方式包括 RT-PCR、Northern、Western 检测来验证 siRNA 的效果。
▐ 4. 如何改善基因沉默的效果？- 提高转染效率：首先可依据转染试剂说明书进行转染条件 (细胞密度，转染试剂用量，转染时间等) 优化尝试，其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞，可考虑更换转染试剂或转染方法 (如电转)。
- 转染过程中使用无血清培养基：血清会阻碍转染试剂与 siRNA 形成复合物，进而影响转染效果。
- 优化 siRNA 浓度：siRNA 最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异，这取决于 siRNA，细胞系和选择的分析方法。推荐 siRNA 工作浓度为 50 nM，也可以使用不同的浓度进行优化实验以达到最佳转染效率。但过高浓度的 siRNA 可能对细胞产生毒性。
- 调整细胞的生长状态：细胞生长状态不好会影响转染效率。
- 重新设计 siRNA：若确定转染效果尚佳，其他因素也分析没有问题的情况下，却没有达到理想的基因沉默效果，则可以尝试重新设计其他 siRNA。
▐ 5. 为什么转染过程中细胞出现大量死亡？
可能原因有：- 转染试剂浓度过高会产生细胞毒性。
- 转染时的培养基中加入了抗生素，这会降低细胞转染的效率，甚至导致细胞死亡。
- 细胞本身状态不佳。
▐ 6. 为什么检测发现靶基因的 mRNA 水平下降了但蛋白水平没有下降？
一般情况下，靶基因 mRNA 的降解直接导致靶基因蛋白表达下降。但是一些情况下也可能出现 mRNA 下降水平但蛋白下降水平并没有下降。
可能原因有：- 真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位置不同。可能 mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平。所以一般建议蛋白检测的时间要稍稍推后。
- 某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以满足细胞功能。转录出来的部分 mRNA 被降解，并没有参与蛋白翻译的过程。因此，mRNA 水平的下降可能没有引起蛋白水平下降。
- 某些基因有多个转录本，而且有可能每个转录本都会编码产生相应的蛋白。而设计的 siRNA 只是针对其中一个转录本，其他的转录本并未受影响，仍正常表达蛋白。
- 可能涉及到其他更加复杂的机制。
▐ 7. MCE 的预设计 siRNA 套装可以用于动物实验吗？- 动物的体内环境复杂，实验周期长，对 siRNA 产品的稳定性提出了更高的要求。所以一般用于动物实验的 siRNA 需要做化学修饰。
- MCE 的套装中的 siRNA 没有做过化学修饰，不适合用于动物实验。MCE 可以提供不同化学修饰的 siRNA 的定制服务。建议客户选择已经验证过效果的 siRNA 序列进行化学修饰，再用于动物实验。
参考文献：
[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2024. Tue. 2 Jul 2024.
[2] Zhu KY, et al. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 2020;65:293-311.
[3] Elbashir, et al. (2001) Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888.
[4] Reynolds A, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004;22(3):326-330.
[5] Amarzguioui M, et al. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun. 2004;316(4):1050-1058.
[6] Jin F, et al. Silencing herpes simplex virus type 1 capsid protein encoding genes by siRNA: a promising antiviral therapeutic approach. PLoS One. 2014;9(5):e96623. Published 2014 May 2.
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