良性和恶性嗜铬细胞瘤的区别

阳光56

　来源：中华病理学杂志

　　【摘要】目的：分析良性和恶性嗜铬细胞瘤在组织形态、免疫组织化学、DNA倍体、11q13和1p的杂合子缺失（LOH）及微卫星不稳定性（MSI）方面的差别，试图找出能区别良、恶性或预测恶性潜能的指标。方法：对22例临床确诊为良性（12例）或恶性（10例）的嗜铬细胞瘤：（1）分析组织形态；（2）免疫组织化学观察Ki-67、p53、嗜铬粒素A、S-100、增殖细胞核抗原及survivin表达；（3）用流式细胞术分析DNA倍体；（4）12例附有正常组织的肿瘤（7例良性，5例恶性）用显微切割获取肿瘤和正常组织，分别提取DNA；用8种引物进行PCR扩增，分析11q13和1p的LOH及MSI。结果：全组22例肿瘤均未见不典型核分裂象，核分裂象数除1例恶性肿瘤为2.3/10HPF外，余均≤1/10HPF，2例恶性肿瘤有广泛坏死。良性组Ki-67阳性细胞百分率明显少于恶性组，良性与恶性组平均Ki-67阳性细胞百分率之比为0.73%∶2.4%，差异有显着意义，DNA倍体良性与恶性组差异无显着性。11q13和1pLOHMSI良性和恶性组的差别由于例数少，未能达到统计学意义。结论：仅Ki-67阳性表达>3%具有区别良恶性或预测恶性潜能的意义。

　　恶性嗜铬细胞瘤仅占嗜铬细胞瘤的10%左右，虽然发生率不高，但由于其临床表现和病理形态与良性嗜铬细胞瘤相同，除了在手术前或手术时发现转移和（或）浸润周围器官组织外，至今还没有可靠的临床或病理指标能区别嗜铬细胞瘤的良、恶性。又由于恶性嗜铬细胞瘤可在手术后数年甚至数十年才发生转移，所以寻找能区别良恶性嗜铬细胞瘤或能预测肿瘤恶性潜能的指标是亟待解决的问题。

　　Thompson[1]比较50例良性和50例恶性肾上腺嗜铬细胞瘤的组织形态和免疫组织化学结果，将组织形态分成12项指标，各项指标阳性者分别得2分或1分，如肿瘤总分≥4分，则表明该肿瘤具有侵袭性生物学行为的潜能，如总分<4则为良性。近年来不少学者用分子生物学和分子遗传学技术分析嗜铬细胞瘤基因杂合子缺失（LOH），认为对阐明嗜铬细胞瘤的发病机制和区别良恶性有一定意义。我们收集了10例有随诊结果确诊为恶性嗜铬细胞瘤和12例良性嗜铬细胞瘤，分析其病理形态、免疫组织化学、DNA倍体以及11q13和1p的LOH和微卫星不稳定性（MSI）。试图找出有用的区别良恶性嗜铬细胞瘤或预测恶性潜能的指标。

　　材料与方法
　　收集北京协和医院1990～2003年间存档并有随诊结果的散发型嗜铬细胞瘤22例。其中10例为恶性，患者年龄20～76岁，平均35.8岁，男性3例，女性7例；肿瘤部位：右肾上腺5例，膀胱2例，另外腹膜后、腹主动脉旁及腹主动脉分叉处各1例。10例中1例手术时已发现肿瘤侵及肾皮质及髓质，1例手术时已有腹腔、肝及纵隔等多处转移，另1例多次复发，12年后再手术见肿瘤已广泛浸润右肾、主动脉及下腔静脉。其余7例在手术后1～15年发生肝、骨、肺、盆腔或淋巴结转移。手术至发生转移的时间平均7.9年。良性12例，年龄25～67岁，平均37.8岁，男性9例，女性3例。肿瘤部位：左肾上腺6例，右肾上腺5例，腹主动脉旁1例。

　　1、病理形态：复习HE切片，按Thompson[1]组织形态分项和计分法将肿瘤形态分成：大细胞巢或弥漫性生长2分，中心性或融合性坏死2分，细胞密集2分，细胞单一2分，梭形细胞2分，核分裂象数>3/10HPF2分，不典型核分裂2分，侵入脂肪组织2分，侵犯血管1分，侵犯包膜1分，明显的核异型性1分，核深染1分，共计20分。按此法对本组肿瘤进行计分。

　　2、免疫组织化学：所用一抗有嗜铬粒素A（CgA），p53，Ki-67，增殖细胞核抗原（PCNA），S-100和survivin。S-100抗体和survivin抗体为多克隆。其余抗体为单克隆。工作稀释度CgA和PCNA为1∶50，survivin为1∶100，p53、Ki-67和S-100为即用型。除survivin购自R&DSystems公司外，其余均购自Dako公司。染色采用EnVision两步法。用微波修复抗原。结果判断：p53、Ki-67和PCNA均以核显色为阳性，CgA及survivin以胞质显色为阳性，S-100则应胞质和胞核均显色才诊断为阳性。每批染色均有阳性和阴性对照。阳性分级标准：阳性细胞数占10%～25%为（+），26%～50%为（++），>50%为（+++）。Ki-67阳性百分率测量用多功能真彩色图像分析系统（北京航空航天大学图像中心）中的组织细胞成分定量分析模块，对切片进行分析。每张切片在阳性细胞较多的区域以200倍视野采集5幅图像，每1个200倍视野中细胞数应>500个。阳性细胞设定为蓝色，阴性细胞设定为墨绿色，对图像的目标自动测量。最后将5个视野阳性细胞综合分析，得出百分率。

　　3、DNA倍体检测：按Hedley等[2]的方法用流式细胞术分析石蜡包埋组织中DNA含量。石蜡包埋肿瘤组织切成30μm厚的切片，放入10ml玻璃离心管中，室温下用二甲苯脱蜡10min×2次，分别经100%，95%，70%和50%乙醇各10min。组织再经蒸镏水洗2次后在1ml含0.5%胃蛋白酶（0.9%NaCl，经2mol/LHCl调节到pH1.5）的液体中制成细胞悬液。将细胞悬液放置在37℃水浴中30min。间歇旋转混合。计数细胞，测试的悬液内细胞数应>105。悬液离心后，将离心所得的细胞小丸重新置于含1μg/mlDAPI的RPMI1640培养液中进行染色，室温30min，然后用尼龙膜过滤，于流式细胞仪（型号EPICSELTTEESP，BeckmanLouter，美国）进行测定。

　　4、LOH和MSI分析：22例嗜铬细胞瘤中仅12例附有正常组织如肾上腺、脾、肾或淋巴结。12例嗜铬细胞瘤（恶性5例，良性7例），系石蜡包埋组织，经常规脱蜡，切片（5μm厚）HE染色，显微切割肿瘤组织和正常组织，以避免微血管、结缔组织等污染，从而获得较纯的瘤组织。37℃蛋白酶K消化组织72h，获得基因组DNA[3]。在α-32P-dCTP（1.11×105GBq/mmol）参入下，用3个针对多发性内分泌肿瘤1型（multipleendocrineneoplasiatype1，MEN1）基因（位于11q13）的标识引物（D11S480，PYGM和D11S449）和5个1p标识引物（D1S468，D1S1597，D1S1598，D1S1665和D1S2708）[3，4]进行PCR扩增肿瘤和正常组织DNA，PCR产物经电泳和干胶后与X光胶片放射自显影曝光。LOH定义：肿瘤DNA等位基因条带和正常组织等位基因条带的密度之比≤50%[3]。MSI定义：和正常组织扩增条带相比，从肿瘤DNA扩增出新的或与正常大小不一致的条带[5]。

　　5、统计学处理：用χ2或t检验。

　　结果
　　1、组织形态：按Thompron[1]提出的项目和计分，本组22例均未找到不典型核分裂象，也未见包膜血管浸润或侵入脂肪组织。典型核分裂象也少，除1例恶性肿瘤核分裂象数达2.3/10HPF外，其余肿瘤核分裂象均≤1/10HPF。良性组5例找到核分裂象，平均核分裂象数为0.26/10HPF，恶性组3例找到核分裂象，平均核分裂象数0.36/10HPF。恶性组有2例出现广泛坏死。按Thompson[1]计分法，良性组12例为2～7分，其中2例为4分，1例为7分。良性组平均3.3分；恶性组10例1～7分，其中7例≥4分，恶性组平均4.6分，P>0.05。

　　2、免疫组织化学：所有病例CgA染色均呈强阳性。S-100阳性的支持细胞良性组：（+）3例、（++）5例、（+++）2例，恶性除2例为（+++）外，其余均<10%。PCNA良性组（++）3例、（+++）2例，恶性组（++）3例、（+++）4例。survivin良性组（+）7例，其余均<10%，恶性组（+）3例，（++）7例。p53仅良性组有1例阳性，阳性细胞共9个/50HPF。Ki-67阳性百分率良性组为0～1.9%，平均0.73%，恶性组0～5.4%，平均2.4%，P<0.05，统计学分析显示Ki-67阳性百分率在良恶性肿瘤的区别中有一定意义。
讨论
　　嗜铬细胞瘤由嗜铬组织发生。全身嗜铬组织分布很广，包括脊柱两旁从颈部到腹腔的交感神经链、肾上腺髓质、Zuckerkandl器、膀胱及脾门等。老的分类将嗜铬细胞瘤分成肾上腺嗜铬细胞瘤和肾上腺外嗜铬细胞瘤。2000年WHO内分泌肿瘤分类中将来自嗜铬组织的肿瘤总称为交感肾上腺付神经节瘤，其中包括嗜铬细胞瘤（亦称肾上腺髓质付神经节瘤）、肾上腺外付神经节瘤和组合性（composite）付神经节瘤。为简化起见本文将沿用嗜铬细胞瘤这一名词，并分成肾上腺嗜铬细胞瘤和肾上腺外嗜铬细胞瘤两大类。嗜铬细胞瘤与多数内分泌肿瘤一样从形态和临床很难区分良恶性。目前公认的诊断恶性的依据是转移，而对恶性嗜铬细胞瘤来说诊断标准更为严格，因为全身嗜铬组织分布广，肿瘤常可多发，所以只有在没有嗜铬组织的器官组织出现嗜铬细胞瘤才能称转移。

　　按Thompson[1]12项形态指标计分，本组12例良性肿瘤中9例<4分，3例≥4分，其中1例为7分；10例恶性肿瘤中仅3例<4分，7例≥4分，其中2例4分，2例6分，3例7分。虽然恶性组的计分明显高于良性组，但差异无显着意义。

　　Rigaud等[6]分析无功能胰岛细胞瘤，结果认为Ki-67阳性百分率>2%加上非整倍体的肿瘤其恶性潜能大，至少临床预后相对差，生存期短。Elder等[7]分析良性及恶性嗜铬细胞瘤和腹腔付神经节瘤的Ki-67和人端粒酶逆转录酶（hTERT）。结果良性组肿瘤10%（2/21）表达hTERT，恶性组肿瘤7/11表达hTERT。良性组肿瘤Ki-67阳性百分率均<1%，恶性组中3/11Ki-67>1%，分别为16%，18%和29%，作者认为联合使用hTERT和Ki-67对区别良恶性有价值。至少hTERT和Ki-67阳性百分率<1%可确定为良性。本组虽分析了Ki-67阳性百分率和DNA倍体但只有Ki-67阳性百分率高有一定的区别意义。

　　嗜铬细胞瘤中，约90%为散发型，其余10%包括常染色体显性遗传的vonHippel-Lindau（VHL）综合征，多发性内分泌肿瘤2型（multipleendocrineneoplasiatype2）和多发性神经纤维瘤1型（type1neurofibromatosis）[8]。近年来有文献报道1pLOH在散发型嗜铬细胞瘤中频繁发生（61%～86%）[8-11]，但是检测1pLOH来鉴别嗜铬细胞瘤的良恶性，尚有待探索。MEN1（11q13）抑癌基因失活（LOH和突变）对于多发性内分泌肿瘤1型的发生至关重要。同时在散发型肾上腺皮质肿瘤中该基因的LOH也有发生[12]。但是嗜铬细胞瘤是否发生MEN1抑癌基因LOH几乎未见报道。我们研究发现，6/12的散发型嗜铬细胞瘤发生MEN1抑癌基因LOH，提示MEN1基因失活可能是散发型嗜铬细胞瘤的致病因素之一。由于MEN1基因LOH的发生在良恶性肿瘤中差异无显着性，因此不能鉴别肿瘤的良恶性。同大部分文献所报道的结果相似我们发现1pLOH发生率高达75%，其中1p31（D1S1665位点）的LOH仅发生在恶性嗜铬细胞瘤中，3例良性嗜铬细胞瘤未能检出1p31（D1S1665位点）的LOH，提示该区域的LOH可能与恶性的表型相关。MSI-H在恶性组达4/5，良性仅2/7，但这些结果由于例数少，需要增加例数进一步研究证实。

　　根据我们的研究结果如嗜铬细胞瘤Ki-67阳性百分率>3%、核分裂>1/10HPF和（或）找到不典型核分裂、有融合性坏死以及出现非整倍体，则此肿瘤极可能是恶性，至少具有很高的恶性潜能。

xiaofeng

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