荧光原位杂交技术（FISH）在泌尿系统肿瘤领域的应用

阳光56

1969年，Gall和Pardue等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建，使FISH 技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990年，Nederlof 等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA 序列，从而宣告了多色FISH技术的问世。

　　FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术，其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性-退火-复性-洗涤后即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

　　FISH技术有以下几点优势：① 安全、快速、灵敏度高；② 探针能较长时间保存；③ 多色标记，简单直观；④ 可用于中期染色体及间期细胞的分析；⑤ 可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。
　二、FISH 技术在泌尿系统肿瘤领域的应用
FISH技术在泌尿系统肿瘤研究方面的应用价值正日益受到人们的关注。现将国内外近年来运用FISH 技术研究泌尿系统肿瘤的相关进展做一简要介绍。

　　1.膀胱肿瘤
　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中，其发病率和死亡率均占首位。早期对膀胱肿瘤做出正确诊断意义重大。用于膀胱癌诊断、监测的传统手段以膀胱镜加组织活检和尿脱落细胞学检查为主。前者直观且准确性较高，但对于肉眼难辨的微小扁平肿瘤发现困难，并且是有创操作，患者痛苦较大，还存在逆行感染的潜在风险；后者特异性高，对高病理分级肿瘤的敏感性也较高，但对低病理分级肿瘤的诊断敏感性则偏低。因此，新型的非侵入性的兼具高敏感性和高特异性的检测手段为人们所期待，而FISH 技术则是目前最接近这一要求的方法。

　　2000年，Sokolova等成功研发了世界上第一种可用于检测膀胱尿路上皮癌的四色FISH 商用探针试剂盒--UroVysion，检测3号、7号、17号染色体及9p21位点。2001年，Bubendorf 等详细描述了UroVysion试剂盒检测膀胱肿瘤的方法，指出该法能显着提高膀胱肿瘤早期检出率。此后涌现大量相关研究报道，讨论的焦点主要集中在FISH 技术与传统检查方法在膀胱肿瘤早期诊断及术后复发监测方面优缺点的比较与评估上。

　　FISH技术检测的敏感性及特异性是人们持续关注的热点问题。各临床试验结果提示，FISH 技术在早期诊断方面具有比尿脱落细胞学检查更高的敏感性，但对低分级肿瘤而言，其绝对敏感性偏低。在诊断的特异性方面FISH 技术略低于尿脱落细胞学检查。

　　FISH技术对于膀胱肿瘤术后复发监测方面有潜在价值。Yoder等公布的一项研究结果表明，约有27 的尿脱落细胞学检查阴性或不典型的患者在尚无明确肿瘤证据时行FISH检测结果呈阳性。经过29个月的随访，这些患者中65例 被证实肿瘤复发。由美国FDA主持完成的一项研究结果显示，36例膀胱镜复查结果呈阴性而FISH检查结果呈阳性的患者，通过随访，15例（42 ）证实肿瘤复发，复发确诊时间为3～16个月不等（平均6.0个月），而在68例膀胱镜检查和FISH检查结果均呈阴性的患者中，只有13例（19 ）在3～19个月（平均11.2个月）的时间里被病检证实为肿瘤复发。那些膀胱镜复查结果阴性而FISH 检测结果阳性的患者被作者称为“预期阳性患者”，这类患者的肿瘤复发时间较FISH 检测结果阴性的术后患者显着缩短（P=0.014）。这一研究结果直接促成了UroVysion探针试剂盒的获准上市。

　　膀胱肿瘤术后患者常规需要进行规律的膀胱药物灌注治疗，常用的药物包括卡介苗（BCG）、吡柔比星、表柔比星和羟基喜树碱等。这些药物均为局部刺激性较大的化疗药物，会引起从肉眼形态到细胞反应各方面不同程度的膀胱炎性改变。这些局部化学性炎症表现常常难以与浅表性的肿瘤复发区分，以致影响到膀胱镜及尿脱落细胞学复查检测工作的准确性。此时，FISH 检测技术的优越性得以显现。Kipp等的一项研究表明，FISH 技术可用于应用BCG 或其它后续治疗的浅表性膀胱肿瘤术后患者恢复及肿瘤复发情况的评估检测，而不会受到上述局部炎性反应的影响。该研究证实，在BCG膀胱灌注疗程结束时，该实验中FISH 检测结果呈阳性的患者中肿瘤复发者是FISH 检测结果呈阴性的患者中肿瘤复发者的4.6倍，在进展至浸润性癌的可能性方面，这一比率高达9.4倍。西班牙学者Mengual 等所做的临床研究同样也对FISH 技术对于BCG灌药的膀胱肿瘤术后患者的监测价值持肯定态度。对65例已行TURBT的膀胱肿瘤患者分别在BCG灌药前后对其尿样标本进行了FISH检测，并随访观察该人群的肿瘤复发情况，结果发现灌药前FISH检测阳性患者占55例（85），灌药后6周这一比例降为29例（45）。灌药后6周FISH检测阳性的患者，其肿瘤复发风险是检测阴性患者的2.7倍，而另一方面，灌药前后FISH检测均呈阳性的患者的肿瘤复发风险是灌药后FISH 检测结果转阴患者的2.96倍。

　　FISH 技术也受到了我国学术界的高度关注。张业贵等报道了其一项为期2年的前瞻性临床试验，收集了57例膀胱肿瘤组织标本，试图通过多色FISH 技术统计染色体畸变情况并分析其与病理分期、分级的关系以及染色体畸变组合诊断膀胱尿路上皮癌的阳性率。结果显示，3、7、17号染色体畸变与临床分期间并无相关性，而与病理分级有显着相关性（P<0.01）。四个探针组合诊断膀胱尿路上皮癌的总阳性率为54.4%。最终结论为FISH 技术检测有助于探索3、7、17号染色体畸变与病理分级的关系。

　　2.肾脏肿瘤
　　已有大量研究表明，肾脏肿瘤的预后与其病理分型密切相关，早期对肾脏肿瘤病理分型具有重要的l临床意义。

　　传统的术前肾细胞癌分型手段为细针穿刺活检术，但该技术存在如下缺陷：① 有创伤；② 对于非均质肿瘤其结论常难以明确；③ 存在肿瘤针道种植的风险。

　　肾细胞癌各亚型均有其独特的分子遗传学特征，这为发展基因水平的新型诊断方法提供了可能性。Junker等收集了25例各型肾细胞癌组织标本，分别用多色FISH 技术及比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization，CGH）对其进行分型鉴定，并与最终病检结果相对照。结果显示，22例肿瘤标本可被FISH 技术正确诊断，在3例标本中FISH及CGH 均未发现基因变异。另有3例标本的病理学鉴定结果在FISH 检测后被修正并被进一步细划出亚型。作者由此认为多色FISH 技术是一种可用于肾细胞癌快速检测与分类的更为高效的实验方法。同样的结论被俄国的Sanjmyatav等及法国的Receveura等在同年相继阐述，其研究方法和结果与前者大致相同。2006年，Barocas等指出，将FISH技术与细针穿刺活检相结合，能有效提高肾细胞癌诊断的准确性，并为其治疗决策的制定提供重要的预后信息。该研究收集了42例肾细胞癌患者的组织标本，在手术切除瘤体后马上对其进行两针细针穿刺，第一针用于细胞的FISH 评估分析，第二针做组织病理学分析，所得结果与最终病理结果进行双盲对比。结果显示，42例肿瘤中有36例为透明细胞癌或乳头状癌，对此36例肿瘤的分型鉴定中，穿刺活检的正确率为75 （27／36）；而FISH 检测的正确率为86 （31／36）。单用穿刺活检的诊断准确率为87%，而二者联合可使该指标升至94%。

　　由此可见，FISH技术在肾脏肿瘤研究方面的优势主要得益于其令人信服的高准确性及操作分析的简便性。这两大优势使FISH技术在肾脏肿瘤研究领域的发展应用前景为人们所寄予厚望。

　　3.前列腺癌
　　传统的前列腺癌早期筛查手段为前列腺直肠指检及血清PSA测定。两者结合是目前公认的前列腺癌最佳初筛方法。但这一组合并非完美，一则直肠指检无法定量描述，另外，血清PSA 由于前列腺癌细胞及非癌细胞均可产生，加之其水平可受许多其它因素干扰而升高，使其早期预测价值有限。事实上，从体格检查与血清学检查这一低端诊断平台向更为深人、更为本质的分子遗传学高端诊断平台的迁移是大势所趋。FISH 技术在前列腺癌诊断及预后方面的研究应用正是基于这一要求的有益探索。

　　Yoshimoto等利用FISH技术对35例已行根治术患者的组织标本和13例前列腺高级别上皮内瘤（HGP1N）患者的穿刺标本进行了检测分析，发现PTEN 基因在24例（68%）前列腺癌患者及3例（23%）HGPIN患者中存在缺失现象。由此推论这一现象可能与前列腺癌的发病存在相关性。同年，Gallucci 等对56例前列腺癌患者的79处肿瘤灶标本运用FISH技术进行了包括7、8号染色体、X性染色体以及EGFR、LPL、MYC和AR基因在内的多项分子生物学检测。结果发现7、8号染色体及x性染色体存在异常的比例分别为96.1%、73.7%及37.1%，没有样本表现出EGER和AR基因的扩增，仅有2.8%的样本表现出MYC 基因的扩增，LPL基因的缺失则在68.4%的患者样本中被发现。Gleason评分与7号染色体异常及8p21位点基因缺失被证实存在相关性，肿瘤分级越高则7号染色体异常的概率就越大。作者认为这些重要的分子遗传学信息将会成为目前传统前列腺癌预后指标的有效补充。

　　Lane等利用FISH技术对7例前列腺癌细胞株及25例已确诊前列腺癌患者的组织标本进行检测分析，发现t（4；6）染色体异位现象较为普遍，可能与前列腺癌的发病密切相关。Matsuyama等对40例前列腺癌患者进行了为期68.5个月的跟踪随访，利用双色FISH 技术及CGH 技术对这些患者体内的8p22位点基因的剂量进行持续监测，结果发现该位点基因的单倍剂量不足可能会影响到前列腺癌的肿瘤特异性生存率，并有可能成为判断其预后的有效分子生物学指标之一。Yoshimoto等运用FISH 技术对历年收集的107例前列腺癌患者的组织标本进行了PTEN基因的分析检测，同时整理了这些患者10年的随访资料，发现PTEN基因的缺失现象在临床预后差的患者中更为多见。规模最大的一项实验研究来自于Attard等实验收集了445例前列腺癌患者的组织标本，运用FISH 技术对TMPRSS2与ERG融合基因的扩增现象进行了追踪与检测，之后将所得到的实验结果与445例患者的预后情况进行了相关性分析，认为该融合基因的复制可作为前列腺癌预后评估的一项指标。

　　迄今为止，人们借助FISH技术已逐渐掌握了前列腺癌许多重要的基因突变信息。对于这一自然特性多变的肿瘤类型，FISH技术的研究应用优势及其重要性已得到越来越多的认可。
三、FISH技术发展应用前景展望
FISH 技术作为连接分子生物学与细胞生物学的桥梁地位已为世人所公认。尽管目前FISH技术无法达到100%完全杂交，特别是在应用较短cDNA探针时存在杂交效率明显下降的问题，但随着各种新型分子探针以及更为精密高端的光学显微镜和功能强大的计算机分析系统的不断问世，上述问题将会逐步得到解决，该技术的作用正变得日益重要，应用领域也得以不断扩展。FISH技术在泌尿系统肿瘤研究领域的巨大潜力与光明前景将引领我们进入全新时代。

xiaofeng

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