Reaction Buffer Concentrate在免疫组化染色中的应用

阳光56

目的：探讨Reaction Buffer对免疫组化制片的影响。

方法：通过使用加入Reaction Buffer的PBS缓冲液和未加入Reaction Buffer的PBS缓冲液分别对免疫组化切片进行冲洗，对比其染色过程中的不同，观察染色结果，并复习相关文献。

结果：使用Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗的免疫组化切片抗体用量偏少，抗体可均匀的覆盖在组织上，非特异性染色减少。

结论：应用Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗免疫组化切片，不仅使抗体均匀覆盖组织，避免因干片产生的非特异性染色，而且节约抗体的用量，节约医疗成本，提高工作效率，值得推广。

　　Reaction Buffer Concentrate（以下简称Reaction Buffer）是罗氏免疫组化仪上所提供的清洗缓冲液，是一种ph7.4-7.8的Tris缓冲液，常用于免疫组化和原位杂交各染色步骤间冲洗切片。为作环境。良好的免疫组化染色是正确判断染色结果的前提和基础，同时影响免疫组化染色结果的因素有很多，包括组织前处理，抗原修复（时间、温度、PH值、离子种类、离子浓度），一抗，二抗，DAB等试剂的孵育时间和温度等[1]。而如何在保证染色质量的前提下降低成本并且缩短时间提高工作效率是我们一直在追求探索的。经过实验发现，在免疫组化滴加一抗前用适当配比的Reaction Buffer和PBS缓冲液的混合液冲洗切片，可减少切片非特异性染色，且因Reaction Buffer的作用，不易出现干片，可一定程度的避免边缘着色现象的出现，且能保证抗体相对均匀的平铺在组织上，也减少了“阴阳脸着色”现象的出现[2]。此方法尤其适合以手工免疫组化制片为主的实验室。本文对分别经过Reaction Buffer-PBS缓冲液及PBS缓冲液冲洗的免疫组化切片进行对照，并将应用体会介绍如下。

　　1、材料与方法
1.1 材料
　　PBS 磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，PH7.2-7.4）、已配制好的Reaction Buffer-PBS缓冲液（Reaction Buffer含量1/3-1/2）、专用免疫组化油笔、吸水纸、湿盒。

　　1.2 方法
　　现将经抗原修复后的组织切片分成3组（A、B、C）放入蒸馏水中备用。

　　A组：常规PBS磷酸盐缓冲液冲洗后，专用免疫组化油笔划圈。

　　B组：Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗。

　　C组：Reaction Buffer-PBS缓冲液洗后，专用免疫组化油笔划圈。

　　将3组处理过的切片进行同样的免疫组化后续操作。
　　2、结果
A组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏多，无需用吸水纸擦拭，同时还有个别组织边缘干燥（图1），发生了边缘效应。

　　B组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，需用吸水纸擦拭（要求距组织边缘2mm处擦拭），未发生组织边缘干燥（图2）。

　　C组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，但每次划圈前均需用吸水纸擦拭，未发生组织边缘干燥。
　　3、讨论
本实验室免疫组化染色标本例数多，手工量大，由于一抗、二抗的孵育时间以及显色时间比较固定，这就要求在操作过程中尽量减少操作时间，并且尽可能地降低非特异性染色。A组为较多实验室所使用的方法，虽然过程简单节省了时间，但由于切片上的滴加的试剂未充分覆盖组织时，边缘的试剂容易先变干，浓度较中间组织高，尤其当组织偏大就更无法保证一次性将滴加的试剂完全覆盖整个组织，只有通过增加抗体用量将组织全部覆盖，抗体用量偏多，并且可能导致抗体覆盖不均，时常出现染色不均，而增加边缘效应、非特异性染色等。B 组直接用吸水纸距组织边缘2mm处擦拭，不需要用免疫组化油笔划圈，抗体也不会四处流失，且擦拭后滴加的一抗会均匀的覆盖在组织上，即节省不少时间又节约了不少抗体。

　　相比之下C组Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗后，因缓冲液均匀的覆盖在玻片上，需用吸水纸擦拭后免疫组化油笔划的圈才能与玻片充分结合，而使用免疫组化油笔的主要目的也只是防止滴加的抗体向组织周边流失，结果与B组无明显差别，但却耽误了时间。Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗后，如同在切片上增加了一层液体膜，虽不会使组织和切片空白区形成明显的分界线，但用吸水纸离组织边缘<2mm处擦拭后，此时滴加的试剂能够佷均匀地分散在所有组织上，使整张切片染色均匀，避免重复滴加试剂，减少用量。由于缓冲液的表面张力作用，被封住的试剂不会向四周流散，且能够在组织上残留相对较多的缓冲液，更好地防止了干片的发生，避免造成边缘效应[3]。

　　该方法在本实验室已使用一年多，与不加Reaction Buffer的 PBS 缓冲液做过多次对照实验，只经过PBS缓冲液清洗便开始滴加抗体，经常会出现试剂仅覆盖了部分组织而不是全部，如试剂未流散开而只集中在部分组织上，致使加完抗体后还需仔细查看一遍，如有组织未被试剂完全覆盖，还需借助吸头、牙签等将试剂引开，使之将组织完全覆盖，从而降低了工作效率，相比之下 Reaction Buffer对免疫组化染色结果无影响，可以放心使用，且为罗氏免疫组化仪配套的清洗液，方便易得，价格也便宜，同时各种抗体的价格昂贵，这样节省了抗体的用量，节约医疗成本，值得推广。另外Reaction Buffer-PBS缓冲液配制方法简单，只需将机器用的Reaction  Buffer与PBS按1:1-1:2的比例混匀即可，此比例经多次实验得出，当Reaction Buffer含量偏多时，切片会有油腻的感觉，即使用吸水纸擦拭也不容易擦净，切滴加的一抗很可能会散到组织范围以外（图3），造成不必要的流失和重复加样，若Reaction Buffer含量太少，则会出现清洗后的切片表面的缓冲液缩聚的现象，使原本覆盖在组织上的一抗范围缩小，进而出现边缘效应或干片。



图1 因切片上的滴加的试剂未充分覆盖组织时，边缘的试剂容易先变干而出现的边缘干燥现象

　　图2 Reaction Buffer-PBS缓冲液冲洗，吸水纸距组织边缘2mm处擦拭，后滴加抗体，均匀覆盖在组织表面

　　图3 Reaction Buffer-PBS缓冲液配制时Reaction Buffer含量偏多，吸水纸擦片不易擦净，滴加抗体时易向周边散出

xiaofeng

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