非小细胞肺癌患者血浆中EGFR总拷贝数及突变的EGFR拷贝数具有诊断肿瘤异质性及评判预后的作用

阳光56

非小细胞肺癌患者治疗必须进行EGFR基因突变分析。目前临床常用的分析样本为组织活检样本。此研究评估了在EGFR-TKI患者治疗过程中进行血浆cfDNA分析EGFR突变情况的临床可行性。研究招募了36位携带EGFR激活突变的非小细胞肺癌患者，并收集给予EGFR-TKI治疗前后的血液样本。采用ddPCR技术对血浆中cfDNA EGFR突变情况进行分析(包括野生型EGFR，L858R，E746-A750，T790M突变)。IV级的患者血浆EGFR拷贝数明显高于I级患者 (3523：1003拷贝/ml, P<0.01)。激活突变尤其是L858R突变，治疗前cfDNA检测结果与组织活检结果高度一致(Kappa index=0.697, P=0.01)。在参与此研究的患者中，34%患者在血浆cfDNA中检测到突变而在之前肿瘤组织中未检测到突变，同样有17%的患者在cfDNA中检测到双突变而在之前肿瘤组织未能检测出。给予EGFR-TKI治疗前血浆EGFR拷贝数高于平均值的患者OS(341 vs. 870 days, p < 0.05)及PFS (238 vs. 783 days; p < 0.05)显著低于EGFR拷贝数低于平均值的患者。同样的，给予EGFR-TKI治疗前血浆EGFR突变拷贝数高于平均值的患者其OS (317 vs 805 days; p < 0.05) 和 PFS (195 vs. 724 days; p < 0.05)显著降低，在随访中，其中53%的患者检测到出现T790M突变。以上结果显示，非小细胞肺癌患者血浆中EGFR含量及突变量分析是一种较好的判断肿瘤分子特征及预后评判的工具。

结果
入驻患者统计学分析及临床特征
本研究入驻36位携带有EGFR突变的非小细胞肺癌患者。29位患者为晚期肿瘤，平均年龄在63±22岁，有69%的女性，55%不吸烟者，其中24位患者接受EGFR-TKI治疗。7位为早期非小细胞肺癌患者，平均年龄为64±24岁，43%的女性患者，43%的不吸烟者。
突变检测的线性
EGFR三种突变检测即使与野生型DNA混合到0.005%也能保持良好线性(图1)：L858R突变 R2= 0.985，E746-A750缺失突变R2= 0.999，T790M突变R2= 0.9314。


非小细胞肺癌患者体内总EGFR拷贝数分析
分析比较了晚期非小细胞肺癌患者与早期患者血浆cfDNA中EGFR拷贝数，结果发现，早期非小细胞肺癌患者(平均值1003拷贝/ml, 四分差(IQR)为776-2697拷贝/ml)血浆cfDNA中EGFR拷贝数要显著低于晚期非小细胞肺癌患者(平均值为3523拷贝/ml，IQR=1544-10603拷贝/ml)(p<0.01，图2)。因为在早期患者cfDNA中未能检出EGFR突变。所以作者为了分析这种拷贝数差异是携带EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者而专有的还是在野生型中也存在这种差异，同时也进行了野生型拷贝数的分析，结果发现在不携带EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR拷贝数也比早期的要高(平均值3525拷贝/ml，IQR=1530-10324拷贝/ml，P=0.016)。虽然如此，在这些患者中，总EGFR拷贝数与肿瘤负荷无相关性(r=0.152, p=0.605)。


血浆cfDNA EGFR突变定量分析
检测发现65% (15/23)晚期非小细胞肺癌患者存在EGFR激活突变，EGFR突变拷贝数/EGFR野生拷贝数比值从0.001到1.44。L858R突变血浆cfDNA与组织检测结果一致性较高(Kappa index=0.697; P=0.001)，达到83%(5/6)。E746-A750缺失突变一致性达到62%(Kappa index=0.31, p=0.154)。

随后，又评估了cfDNA分析检测肿瘤异质性的作用。在12%患者血浆cfDNA中检测到EGFR L858R激活突变，而在肿瘤组织中此12%的患者L858R阴性。同样的情况也出现E746-A750缺失突变检测中，有31%的患者在血浆cfDNA中阳性，而肿瘤组织中阴性。T790M突变在肿瘤组织中都未能检测出，但是血浆cfDNA检测中发现有13%的患者存在此突变，突变拷贝数/野生型拷贝数范围从0.003到0.1不等。血浆cfDNA同样检测到17%的患者存在EGFR双突变情况，而肿瘤组织中未能检出，两位患者组织活检中分别存在L858R与E746-A750突变，但在血浆cfDNA中同时检出存在T790M突变。另两位患者组织活检中检测存在E746-A750缺失突变，但是cfDNA检测中同时检出存在L858R突变。7位早期非小细胞肺癌患者血浆cfDNA未能检测出任何EGFR突变。

血浆cfDNA定量分析的预后评判价值
将晚期非小细胞肺癌患者血浆中所含激活型突变EGFR平均值94拷贝/ml作为临界值。低于此临界值的患者有着较长的OS值(平均值805天，IQR=635-974天)，而高于此临界值的患者OS值较短(平均值317天，IQR=102-531天)(P=0.018，图3a)。同样的低于此临界值的患者有着较长的PFS(平均值724天，IQR=488-960天，而高于此临界值的患者PFS较短(平均值195天，IQR=55-335天)(P=0.03，图3b)。有意思的是，总EGFR拷贝数低于平均值(3462拷贝/ml)的患者 (平均值870天，IQR=738-1001天)相比总EGFR拷贝数高于平均值的患者(平均 341天; IQR = 183 – 498 天; p < 0.05))有着更长的OS值(图3c)。在PFS研究中，也存在类似的结果，低于均值的患者平均PFS为783天(IQR=552-1014天)，高于均值的患者平均PFS为238天(IQR=129-346天)(p<0.05，图3d)。事实上，在一年内死亡的患者(2.19 EGFR拷贝/ng cfDNA, IQR=1.45-6.30)血浆总cfDNA中总EGFR拷贝要高于同期生存的患者(平均值0.82 EGFR 拷贝/ng cfDNA, IQR=0.55-2.43, p=0.012)。

晚期非小细胞肺癌患者随访过程中血浆cfDNA EGFR突变情况
晚期非小细胞肺癌患者接受EGFR-TKI治疗随访过程中也同时连续进行了EGFR突变的定量分析(图4)。结果发现，随访过程中，血浆中激活突变的EGFR总量随着治疗过程的进行而减少(基准线65%，最好反应的患者31%)，随疾病进展后又升至42%。同样E746-A750突变拷贝数同样减少(基准平均值27拷贝/ml, IQR=17-536拷贝/ml，最好反应率患者的平均值0拷贝/ml，IQR=0-28拷贝/ml)，但未达到统计学意义(P=0.068)，野生型的也减少(基准平均值21932拷贝/ml, IQR=1075-45011拷贝/ml，最好反应率患者平均值1072拷贝/ml，IQR=1029-7152拷贝/ml)，同样未达到统计学意义(P=0.27)。相反，T790M随着治疗过程的进行，由原来的13%，上升到疾病进展后的42%。

讨论
此研究，作者评估了血浆中EGFR总量与突变的EGFR总量的临床意义。结果发现，早期非小细胞肺癌患者血浆中野生型EGFR拷贝数明显低于晚期的患者，而在治疗过程中，对药物有反应的患者其循环EGFR拷贝数明显降低。此研究中，晚期非小细胞肺癌患者有65%的均存在EGFR突变，而早期患者并没有检测到EGFR突变，同样也说明分析血浆cfDNA中EGFR突变比较适用于晚期患者。同时分析血浆cfDNA中EGFR突变是对组织活检的一个有力补充，可以弥补组织活检漏检的情况。此研究建立的ddPCR系统可以检测到0.005%的突变，远高于其他方法的灵敏度。因此，此研究结果证实血浆中EGFR拷贝数随着肿瘤分级的增加而增加，ddPCR法是一种可以弥补组织活检漏检缺点的，灵敏度较高的检测血浆cfDNA中EGFR突变的方法，此方法也能发现肿瘤异质性，更证明治疗前EGFR总拷贝数及突变的EGFR拷贝数具有指示临床预后的作用。