三阴性乳腺癌间质肿瘤浸润淋巴细胞表达CD8和FOXP3的临床病理分析

阳光56

乳腺癌是一种具有不同生物学特性和临床预后的多亚型异质性疾病[[url=]1[/url]]。其中三阴性乳腺癌(TNBC)预后差，其特征为缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)的表达[[url=]2[/url]]。三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的10%～17%，通常这些肿瘤间质有显著的淋巴细胞浸润[[url=]3[/url]]。通过对肿瘤HE染色切片的简单测评来评估淋巴细胞浸润程度，已经被证实对于TNBC有预后和预测价值[[url=]2[/url],[url=]3[/url],[url=]4[/url],[url=]5[/url]]。在各种实体瘤患者中，免疫细胞特定亚型的出现与临床反应有重要的相关性[[url=]6[/url]]，其中乳腺癌的大量肿瘤浸润性CD8＋细胞毒T细胞(cytotoxic T cell，CTL)与患者生存期[[url=]7[/url]]及对治疗的反应密切相关[[url=]8[/url]]，指叉头框蛋白3(FOXP3)阳性调节性T细胞(regulatory cells，Treg)在抑制抗肿瘤免疫中发挥重要作用[[url=]9[/url],[url=]10[/url]]。越来越多的研究表明，这些肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)对患者预后的影响取决于浸润细胞的种类、功能状态、浸润细胞在肿瘤组织中的定位及与肿瘤细胞的相互作用[[url=]11[/url]]。我们通过评价160例TNBC的HE染色切片中间质TIL百分比，并采用免疫组织化学法检测CD8及FOXP3的表达以分析CTL和Treg的浸润情况，旨在探讨TNBC中间质TIL、CTL和Treg细胞亚型的特点及相互关系。

资料与方法

1．临床资料：

收集南京医科大学第一附属医院病理科2012—2014年病理资料完整的女性TNBC[ER－、PR－、HER2－和/或荧光原位杂交技术(FISH)检测HER2/neu基因无扩增]手术及穿刺标本165例，其中手术标本145例，穿刺标本20例。患者年龄25～84岁，中位年龄51岁。所有标本均经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，HE切片经高年资医师复核诊断，术前均未行放、化疗及其他针对肿瘤的治疗。按2012年WHO乳腺肿瘤病理学和遗传学分类标准对乳腺癌进行分型、分级，筛选出浸润性癌(非特殊类型)160例，组织学分级：Ⅰ级1例、Ⅱ级43例、Ⅲ级116例；另外5例特殊类型乳腺癌(伴有大汗腺分化的癌、伴有髓样癌特征的癌、化生性癌、腺样囊性癌和浸润性微乳头状癌各1例)被剔除。

2．试剂：

兔抗人单克隆抗体CD8购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔多克隆抗体FOXP3购自Abcam公司。免疫组织化学MaxVision试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

3．免疫组织化学检测：

兔抗人单克隆抗体CD8为即用型抗体，兔多克隆抗体FOXP3按预实验结果1∶100稀释。滴加一抗后置4 ℃冰箱孵育过夜；新鲜配制二氨基联苯胺溶液，显色3～5 min；苏木精对比染色，分化，脱水，透明并封固。乳腺癌微环境中浸润淋巴细胞主要有以下分布方式：肿瘤内部浸润的淋巴细胞弥漫散在分布于肿瘤细胞巢内，并与肿瘤细胞直接接触，没有明显的聚集趋势，即肿瘤内TIL；肿瘤浸润边界以内的间质中未与癌细胞直接接触的淋巴细胞，包括浸润边界区的淋巴细胞，即间质TIL；还有一部分淋巴细胞远离浸润边界区，浸润的淋巴细胞较丰富并集中分布，通常呈淋巴样聚集，甚至在一些病例中可见淋巴滤泡样结构形成，即三级淋巴结构。我们参照Salgado等[[url=]6[/url]]推荐的HE切片中TIL评价方法，重点关注间质TIL。在高倍视野(×400)下观察TIL占肿瘤浸润边界以内间质面积的百分比，取整个切片区域的平均值；排除肿瘤边界之外、原位癌及正常小叶周围的TIL；排除肿瘤区域内人为挤压、坏死、玻璃样变以及先前穿刺活检部位的TIL。所有单个核细胞(包括淋巴细胞和浆细胞)都应评价，但多核白细胞排除在外([url=]图1[/url]，[url=]图2[/url]，[url=]图3[/url]，[url=]图4[/url])。间质CD8＋CTL、FOXP3＋Treg，指间质TIL中CD8阳性、FOXP3阳性的淋巴细胞。FOXP3＋Treg表达在胞核呈棕色着色，CD8＋CTL表达在细胞膜呈棕色染色。对CD8＋CTL及FOXP3＋Treg采用如下计数方法：肿瘤间质中，低倍镜(×100)下选取淋巴细胞最丰富的区域(5个)，高倍视野(×400)下对上述区域进行细胞计数。结果以5个视野细胞平均值表示(细胞数均值/HPF)。在同一肿瘤组织连续切片中，分别在相同的5个选定区域内进行CD8＋CTL及FOXP3＋Treg的计数，计算二者比值及5个视野细胞平均值([url=]图5[/url]，[url=]图6[/url])。

图1～4

三阴性乳腺癌，紧密排列的癌细胞呈片状、条索状侵入邻近的纤维间质中，浸润边界及间质区通常伴有数量不等的淋巴浆细胞浸润　HE　图1示肿瘤浸润区及浸润边界均包含在内，原位癌及正常小叶周围和浸润区外的淋巴样聚集区均不评估，红色箭头所示为浸润区外的淋巴样聚集区，蓝色箭头所示为浸润边界的淋巴细胞　低倍放大；图2示高间质TIL百分比　中倍放大；图3示低间质TIL百分比　中倍放大；图4示间质区含较多浆细胞，红色箭头所示为肿瘤内TIL，蓝色箭头所示为间质TIL　中倍放大

图5，6

三阴性乳腺癌组织肿瘤内部浸润的淋巴细胞呈弥漫散在分布于肿瘤细胞巢中，间质浸润的淋巴细胞包括浸润边界区的淋巴细胞　MaxVision法　高倍放大　图5示FOXP3＋细胞；图6示CD8＋细胞

4．统计学方法：

所有研究数据采用SPSS 20.0进行处理，淋巴细胞变量与临床病理学因素之间的相关分析采用Spearman秩相关性检验，P<0.05示差异有统计学意义。

结果

1．CD8＋CTL和FOXP3＋Treg浸润密度、CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值与TNBC临床病理特征的关系([url=]表1[/url])：

表1 CD8＋、FOXP3＋和CD8＋/FOXP3＋与乳腺癌临床病理特征的关系[例数(%)]

本组病例中150例检测出CD8＋CTL浸润密度，数值范围(4.25～244.50)/HPF，中位值48.15/HPF；146例检测出FOXP3＋Treg浸润密度，数值范围(1.30～211.50)/HPF，中位值18.90/HPF；CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值范围0.23～49.85，中位值2.91。CD8＋CTL和FOXP3＋Treg浸润密度及CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值均以中位数作为临界值分组。CD8＋CTL与肿瘤大小呈负相关(r＝－0.214，P＝0.009)，与Ki－67呈正相关(r＝0.188，P＝0.021)，与患者年龄、组织学分级、前哨及腋窝淋巴结状态均无相关性。FOXP3＋Treg与患者年龄呈负相关(r＝－0.179，P＝0.030)，与组织学分级呈正相关(r＝0.184，P＝0.026)，与肿瘤大小、前哨及腋窝淋巴结状态、Ki－67均无相关性。CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、前哨及腋窝淋巴结状态、Ki－67均无相关性。

2．CD8＋CTL、FOXP3＋Treg浸润密度和CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值与间质TIL的关系：

间质TIL与CD8＋CTL细胞呈正相关(r＝0.200，P＝0.014)，与FOXP3＋Treg细胞、CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值无相关性([url=]表1[/url])。

3．间质TIL百分比与TNBC临床病理特征的关系：

间质TIL百分比范围2%～90%，平均值39%，中位值40%，以中位数作为临界值分组。间质TIL与Ki－67呈正相关(r＝0.237，P＝0.002)，与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、前哨及腋窝淋巴结状态均无相关性。

讨论

肿瘤微环境中，浸润性淋巴细胞被认为在宿主对肿瘤的免疫中发挥重要作用[[url=]11[/url]]。BIG2－98试验在2009例淋巴结阳性乳腺癌的研究中发现较高的间质TIL百分比与高表达Ki－67相关[[url=]5[/url]]。FinHER试验也证实乳腺癌中间质TIL与Ki－67呈正相关[[url=]12[/url]]。我们的结果同BIG2－98、FinHER试验一致，提示间质TIL百分比的增高与肿瘤细胞本身的分化及增殖程度有关。肿瘤转化改变了正常组织结构并且引起免疫反应，肿瘤进展和免疫细胞的相互作用分3个阶段：消除、平衡和逃逸。本组结果印证了肿瘤和宿主免疫之间的这种关系，伴随抗肿瘤免疫应答强度的改变。美国东部合作肿瘤协作组(ECOG)试验2197及1199，在481例TNBC中发现TIL和淋巴结状态相关[[url=]3[/url]]。而我们并未得出相似结论，这可能与我们选择的淋巴结处理方式有关。我们观察了前哨淋巴结状态和腋窝淋巴结状态2个参数，并且病例数相对较少。

本组结果显示，CD8＋CTL浸润密度与肿瘤直径呈负相关、与Ki－67呈正相关。CD8＋CTL是肿瘤特异细胞获得性免疫的重要组成，它通过肿瘤相关抗原肽与其表面主要组织相容性复合体Ⅰ结合来攻击肿瘤细胞。我们的结论提示增殖活性高的肿瘤细胞可能提高CTL的免疫活性，CD8＋CTL可能与高增殖活性的肿瘤相互作用后产生γ－干扰素，γ－干扰素依赖的肿瘤杀伤机制通过抑制细胞循环、血管生成及促进细胞凋亡来实现。Mahmoud等[[url=]7[/url]]对1 334例乳腺癌病例的研究发现，CD8＋CTL与肿瘤组织学分级呈正相关，与患者年龄、ER、PR表达呈负相关。Liu等[[url=]11[/url]]对1 270例乳腺癌的分析中得出，瘤周CD8＋CTL与临床病理特征均不相关。Miyashita等[[url=]9[/url]]对88例TNBC活检标本的研究显示，CD8＋CTL均与临床病理特征无相关性。上述研究结果之间的差异可能源于标本形式(组织芯片、活检标本或手术标本)或病例数量上的不同。

FOXP3＋Treg通过不同机制抑制一系列的免疫反应，促使肿瘤细胞产生免疫耐受、逃逸。Mahmoud等[[url=]13[/url]]对1 445例乳腺癌病例分析后发现FOXP3＋Treg与肿瘤组织学分级呈正相关、与年龄呈弱的负相关。Liu等[[url=]14[/url]]在3 277例乳腺癌研究中得出高水平间质FOXP3＋Treg与高组织学级别、年轻患者相关。本实验与Mahmoud等[[url=]13[/url]]、Liu等[[url=]14[/url]]的结果一致，提示FOXP3＋Treg对维持自身免疫耐受至关重要，年轻患者及高组织学级别通常提示不良预后，因此FOXP3＋Treg可能通过可逆地干扰CD8＋ T细胞释放细胞溶解颗粒来抑制效应器CTL，从而阻碍靶细胞裂解[[url=]15[/url]]；可能促进CD4＋T辅助淋巴细胞形成FOXP3＋Treg，募集FOXP3＋Treg至肿瘤部位，引发原发部位Treg细胞的增生。这种FOXP3＋Treg的增殖成为癌症免疫疗法的潜在障碍[[url=]16[/url],[url=]17[/url]]。

关于浸润淋巴细胞的研究，研究者们认为同时检测CTL和Treg能够更准确地评价肿瘤的预后[[url=]18[/url],[url=]19[/url]]。我们的研究中CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值与传统的临床病理学指标均无相关性，然而并不能因此否认其对肿瘤的预后作用，相关的生存分析有待在未来工作中完善。

本研究目的之一即以免疫组织化学方法标记肿瘤间质TIL中CTL、Treg的浸润、分布情况，观察间质TIL指标与2个重要免疫细胞亚型(CTL和Treg)的关系，以获得互相印证、互相补充诊断的作用。本实验结果提示间质TIL百分比与CD8＋CTL浸润密度呈正相关，与FOXP3＋Treg浸润密度、CD8＋CTL/FOXP3＋Treg比值无相关性，提示HE形态下的间质TIL可能更多地反映了CTL的功能状态，在未来的诊断中它们可能发挥相互印证及补充的作用。

综上所述，TNBC中间质TIL百分比、CD8＋CTL浸润密度可能与乳腺癌细胞增殖相关，FOXP3＋Treg浸润密度可能与乳腺癌不良预后相关，并且间质TIL百分比与CD8＋CTL浸润密度呈正相关。我们的结果提示了间质TIL百分比是乳腺癌组织形态学评价的一项有前景的指标，并可能成为TNBC临床病理诊断、辅助治疗及改善预后的切入点。

• [url=]潘贝晶[/url]
• [url=]平国强[/url]
• [url=]张炜明[/url]
• [url=]王聪[/url]
• [url=]李红霞[/url]
• [url=]张智弘[/url]
• 
  

中华病理学杂志, 2016,45(08)

以下内容和版式版权归属中华医学会，未经授权不得转载

×

xiaofeng

感谢分享

看了又看

学习。