乳腺癌中雌激素α受体36与HER2表达的相关性

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：李占勇，李沐声，于佳乐，林璐璐，张景义（内蒙古自治区赤峰学院附属医院病理科）

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雌激素α受体（ERα）36是相对分子质量为36000的ERα剪接变异体，由Wang等[1]在2005年首次确定并克隆。ERα36的表达失调与包括乳腺癌在内的大多数疾病有密切关系。我们利用乳腺癌细胞系MCF－7，通过高表达ERα36蛋白后检测细胞内相关蛋白表达量的变化，分析ERα36与HER2及维甲酸受体（RAR）之间可能的调节机制。

材料与方法


1.实验材料：

　　真核表达载体pIRES2－EGFP及人类乳腺癌细胞系MCF－7购于中国医学科学院基础医学研究所。ERα36抗体由北京申奥基医药科技公司惠赠；HER2抗体（克隆号SP3）购于德国Leica公司，RARα抗体（克隆号H1920）购于美国Abcam公司。

　　2.细胞培养：

　　DMEM培养基常规培养MCF－7细胞，取对数生长期的MCF－7细胞进行实验。

　　3.pIRES2－EGFP－ERα36真核表达载体的构建：

　　针对ERα36基因的CDS区序列设计并合成5条寡聚核苷酸片段，并在基因的5′端添加BamHⅠ酶切位点，3′端添加NheⅠ酶切位点。PCR扩增条件为：94℃30s，58℃30s，68℃30s循环35次。将目的基因PCR产物和目的载体用NheⅠ和BamHⅠ分别进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用回收试剂盒回收目的片段。T4 DNA ligase连接上述酶切后的PCR产物及目的载体，制备感受态细菌，抽提质粒、测序，得到pIRES2－EGFP－ERα36真核表达载体。

　　4.pIRES2－EGFP－ERα36转染MCF－7细胞：

　　将转染试剂混合液滴加到MCF－7细胞中，转染72h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率，拍照记录。收集细胞，抽提总RNA及总蛋白，即时定量PCR及Western blot方法检测转染后细胞ERα36的mRNA和蛋白质表达量。

　　5.免疫组织化学染色：

　　去除培养基，加入PBS，加入胰蛋白酶消化细胞，离心获得细胞沉淀，4%中性甲醛固定，滤纸包裹，常规脱水、浸蜡、透明、石蜡包埋及切片。全自动免疫组织化学染色机BondTM Polymer Refine Detection染色法检测ERα36、HER2、Ki－67蛋白。

　　6.Western blot检测HER2和RARα蛋白表达：

　　收集总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉中室温封闭2h。一抗4°C孵育过夜，二抗37℃孵育3h，ECL发光，凝胶成像系统分析。

　　7.统计学处理：

　　使用SPSS17.0软件进行数据分析，两变量间的相关性分析用Spearman相关系数，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果


1.pIRES2－EGFP－ERα36真核表达载体转染MCF－7细胞及鉴定：

　　转染72h后，约70%的细胞出现绿色荧光信号。即时定量PCR法检测ERα36mRNA在MCF－7细胞中的表达，与阴性质粒转染组相比，MCF－7基因过表达129.23倍。Western blot方法检测ERα36蛋白表达结果提示，转染了pIRES2－EGFP－ERα36的MCF－7细胞表达ERα36蛋白，而阴性质粒转染组未见表达，2种方法均证实pIRES2－EGFP－ERα36成功转染了MCF－7细胞，ERα36蛋白成功在MCF－7细胞中表达。

　　2.免疫组织化学法检测细胞内蛋白表达的变化：

　　转染pIRES2－EGFP－ERα36重组质粒后的MCF－7细胞，ERα36着色定位于癌细胞质和/或细胞膜中，HER2蛋白表达增加，部分肿瘤细胞胞膜出现阳性着色（图1），Ki－67阳性指数略有增高，提示ERα36蛋白促进肿瘤细胞增殖。

乳腺癌中雌激素α受体36与HER2表达的相关性

图1 转染重组质粒重组质粒后的MCF－7细胞HER2蛋白表达量增加免疫组织化学 中倍放大 图A 示重组质粒组，图B 示空质粒转染组。

　　3.MCF－7细胞内HER2及RAR蛋白表达的变化：

　　pIRES2－EGFP－ERα36重组质粒组与空质粒组相比，HER2蛋白表达量增加，而RARα蛋白表达减少（图2）。统计分析发现，ERα36与HER2的表达量呈正相关（γs＝0.536，P<0.05）；ERα36与RARα的表达量呈负相关（γs＝－0.413，P<0.05）。

乳腺癌中雌激素α受体36与HER2表达的相关性

　　图2 Western blot检测示转染ERα36后，HER2蛋白表达增多，RARα表达减少。

讨论

ERα36是新发现的ERα剪接异构体，与经典的ERα66相比较，ERα36缺少AF1和AF2这2个转录激活结构域，但仍保留DNA结合结构域和部分二聚体化及雌激素结合结构域[2]。ERα36可能通过非基因组作用模式（膜启动的雌激素应答），快速激活细胞内信号转导通路，主要包括ERK/MAPK信号通路、RAS－PI3K通路、JNK通路及第二信使系统等，使细胞产生快速反应，促进细胞发生增殖及恶性转化。HER2在肿瘤细胞的生长、分化及存活中均起着重要的调节作用，并且参与调节正常乳腺细胞的生长和发育。既往研究已经证实乳腺癌中HER2蛋白过表达可促进癌细胞增殖，同时抑制其凋亡，增加癌细胞浸润转移能力，也有研究显示HER2过表达提示肿瘤恶性程度较高，并可伴有淋巴管及血管侵犯，且患者的无病生存期和总生存期均缩短[3]。

　　HER2蛋白与ERα36蛋白之间的相关性已有报道，尽管采用的研究方法不同，但多数研究结果支持HER2蛋白与ERα36蛋白表达之间存在正反馈调节，这与我们的结果相同。在本研究中，转染pIRES2－EGFP－ERα36重组质粒后MCF－7乳腺癌细胞ERα36高表达，HER2蛋白表达量也随之上调，Ki－67阳性指数同时增加，提示ERα36可能通过某种机制上调HER2蛋白的表达，促进肿瘤细胞增殖，二者通过非基因组途径协同促进乳腺癌细胞增殖及转移。有研究发现在原发性乳腺癌中ERα36和EGFR共表达显著，表明ERα36参与了EGFR相关致癌作用。进一步研究阐明，表皮生长因子可通过影响ERα36的表达，以时间和/或剂量依赖模式诱导ERK1/2磷酸化。正反馈回路证实，EGFR信号通过ERα36的启动子中的AF1结合位点激活ERα36转录。反之，ERα36与EGFR/Src/Shc复合体相互作用，从而加强EGFR信号通路调节和稳定EGFR蛋白表达。有报道显示在ERα36和HER2间存在类似的反馈回路[4]。

　　新近有研究证实RAR与ER之间存在广泛的交叉对话（crosstalk），研究人员通过比较雌激素与维甲酸对整个基因组的影响，发现了一种“阴阳效应”：这两种分子能改变许多相同基因的表达，其中雌激素有利于细胞增殖，而维甲酸则能通过抑制细胞生长来维护这个平衡[5]。RAR属于核受体超家族，包括α、β、γ三种。以往的研究主要集中在RARβ，对RARα和RARγ关注较少。RAR通过与其配体维甲酸结合后，作为一种重要的转录因子调节靶基因转录发挥各种生物学效应，在脊椎动物生长、发育和细胞分化尤其是胚胎发育过程中有重要作用，调节脊椎动物胚胎发生过程中多方面的形态形成，同时在诱导肿瘤细胞分化和凋亡方面也起重要作用。关于RAR在乳腺癌细胞中表达水平下调的机制，有研究报道可能与启动子区域甲基化[6]、染色体等位基因缺失等结构或功能方面的变化相关，也可能RAR诱导基因1等基因的调节作用有关，目前尚未阐明。我们发现，MCF－7细胞高表达ERα36后，其RARα蛋白表达量下降，提示ERα36可能参与了对RARα的负调控，具体的调控机制尚不清楚，有待于进一步的研究证实。

　　我们发现高表达ERα36的乳腺癌细胞系MCF－7中RARα表达量降低，而HER2表达量增加，推测RARα与HER2之间可能存在负反馈调控。ERα36可能通过下调RARα促进HER2蛋白表达增加。关于其中的作用机制，我们分析，RAR作为一种肿瘤抑制基因，在转录水平上抑制多种肿瘤相关基因（尤其是HER2）的表达，其表达量的下降导致相关基因表达量增加，促进肿瘤细胞增殖、恶性转化及迁移。当然，ERα36与HER2之间的调节机制远非如此简单，可能是包括基因组效应及非基因组效应在内的多种因素联合作用的结果，这有待进一步研究来证实。

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