胃癌HER2检测的标准化研究进展

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：龙晓雨，步宏，刘键平（四川大学华西医院病理科）

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　　胃癌是常见的恶性肿瘤，外科手术切除是胃癌的首要治疗方式，早期胃癌患者通过手术可以治愈[1]。但多数胃癌患者在确诊时已达中晚期，即使采用围手术期化疗或辅助化疗，这些患者的生存率仍然较低[2-3]。因此，寻找新的治疗途径如分子靶向治疗成为胃癌研究的热点。HER2/neu是表皮生长因子受体家族成员之一，其基因定位于染色体17q21，编码相对分子质量为185000的跨膜酪氨酸激酶受体[4]，即HER2蛋白。近期研究显示，HER2在多种癌症的发生中起到了作用，HER2过表达（或扩增）可在10%-34%的浸润性乳腺癌[5]以及7.1%-42.6%的胃癌或胃食管交界癌中检测到[6-7]。此外，在结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮内膜癌、肺癌、宫颈癌、食管癌中也有HER2过表达（或扩增）的报道[5]。

　　近年来，靶向HER2蛋白的单克隆抗体——曲妥珠单抗（trastuzumab；商品名赫赛汀，Herceptin）被证实能提高原发性和转移性HER2阳性乳腺癌患者的生存率[8-9]。为准确挑选最适宜的患者接受治疗，同时避免某些患者不必要的用药，2007年美国临床肿瘤协会（ASC0）/美国病理医师学院（CAP）联合发表了乳腺癌HER2检测指南[10]，对乳腺癌HER2检测的技术路线、结果判读标准、质量控制等多方面提出了新要求，是具有循证医学意义的参考，标志着HER2的检测向标准化迈进了一大步。而在胃癌中，相关研究起步稍晚。新近一项包括中国在内的24个国家参与的全球多中心III期临床试验（ToGA）揭示了曲妥珠单抗对HER2阳性晚期胃癌和胃食管交界癌患者的疗效[11]，随后美国食品和药品管理局（FDA）批准了该药联合化疗治疗HER2阳性转移性胃癌和胃食管交界癌患者[12]。胃癌HER2的检测将在多个病理科开展，与乳腺癌HER2的检测相比，胃癌中HER2的检测有何异同？适用于乳腺癌的HER2检测指南是否适用于胃癌？胃癌HER2的检测也面临标准化的问题，本文对胃癌HER2检测的标准化研究进展作一综述。

　　一、免疫组织化学（IHC）检测的标准化研究

　　目前，国内外一般采用IHC法检测HER2蛋白表达状态。在胃癌中，不同研究报道的HER2蛋白过表达率不一致，大部分集中在6.8%~34.0%[7]，且关于胃癌HER2的预后意义，结论尚未统一[13]。由于IHC技术本身的复杂性，诸多因素会造成检测结果的差异，故有必要对IHC检测流程进行标准化。

　　1.组织检测前的处理：组织处理是IHC检测过程中的重要环节，处理方法不同直接影响实验室间检测的可重复性。2011年比利时胃癌HER2检测指南提出[14]，应使用4%中性缓冲甲醛液作为固定剂，组织离体后尽快固定，最迟不超过1h，固定时间以6~48h为宜，用于原位杂交的标本不宜固定过度。手术切除标本应行切开固定，以保证组织固定充分。这些要求与ASC0/CAP乳腺癌HER2检测指南基本一致。

　　2.关于抗体选择：HER2检测有多种商品化抗体可供选择，不同抗体间敏感性的差异会直接导致检测结果的差异。目前FDA认证了HercepTest（Dako公司）、4B5（Ventana公司）和CB11（Novocastra公司）等几种用于乳腺癌HER2检测的抗体或试剂盒。ToGA试验使用HercepTest，结合荧光原位杂交（FISH）结果得出胃癌HER2的阳性率为22.1%[15]。RUschoff等[16]在胃癌中比较了HercepTest和4B5，认为两者敏感性相当，但使用4B5可能提高实验室间的可重复性，且更能体现IHC3+与HER2基因扩增之间的关联。Grabsch等[13]在胃癌中分别使用Biogenex公司和Novocastra公司的CB11，得出的HER2阳性率均不到10%。CB11抗体的敏感性是否低于以上其他的抗体，还需更多研究数据来证实。

　　3.关于结果判读及注意事项：以往的研究多采用乳腺癌HER2现有的评分系统，如HercepTest评分系统和ASC0/CAP检测指南评分系统，但仍有研究采用非膜阳性的评判标准[17]，也有研究采用5%作为阳性临界值[13]。目前国际上尚无公认的胃癌HER2IHC阳性评判标准。早在ToGA试验之前，Hofmann等[6]在乳腺癌HercepTest评分系统的基础上提出了胃癌HER2改良评分系统（the modified HER2 scoring system，表1），用于ToGA试验病例的筛选。该研究认为乳腺癌HercepTest评分系统基本可适用于胃癌，但有两点需要修正：首先，由于胃癌腺腔形成较乳腺癌更为常见，瘤细胞的腔缘面可能保留分泌功能而不被标记染色，形成U型（基底和双侧面）的不完整膜染色。故在胃癌中IHC2+和3+不需要完全的细胞膜染色，“U型”染色代替了乳腺癌中的“O型”染色。其次，由于胃癌的肿瘤异质性（4.8%）比乳腺癌（1.4%）更常见，胃镜活检标本的代表性有所降低，故在活检标本的分析中取消了细胞着色比率（10%）的临界值，但未给出满足阳性判断的具体细胞数目或比率。



　　胃癌HER2改良评分系统提出以后，陆续被许多研究者采用。Ruschoff等[16]在2009年一项研究中对该评分系统进行了验证和完善，并提出了分步判读流程（图1）。该研究包括4个步骤，第一步把载有相同胃癌样本的组织芯片提供给法国和德国的8个实验室，分别进行HER2检测和判读（按照改良评分系统），以评估实验室间的可重复性。并在当年3月召开会议讨论了各个实验室的结果，发现造成实验室间不一致的主要原因并非组织芯片染色差异，而是各个实验室对评分系统的理解不到位。会议最终在评分系统的理解上达成了一致，接下来把载有547例胃癌样本的组织芯片提供给与会的6位德国病理学家，各自独立阅片，以评估观察者间的可重复性，这是第二步。

第三步进入总结和创新阶段，研究者于当年6月再次召开会议讨论547例样本中评分不一致的病例，找出了一些容易导致观察者间不一致的“陷阱”，并对胃癌HER2改良评分系统做出了三点完善：

（1）关于膜阳性的判断：膜阳性必须是肿瘤细胞连接处线性的膜着色。首先要排除非肿瘤组织的着色，如肠化生的胃上皮和溃疡周边反应增生的组织。还有IHC染色的边缘效应、组织挤压造成的浓集假象以及核质着色也需在第一时间排除，这些情况对初学者有一定迷惑性；其次是膜阳性部位的精确定义，必须在细胞连接处（cell-cell contact sites），对于极性尚存的肿瘤细胞，仅有三种着色模式可纳入膜阳性的考虑，即完全的、基底双侧的、仅有双侧的膜着色。由于细胞腔缘和基底面并非细胞连接处，仅有腔缘或基底面着色的模式均判为0。对于极性消失或弥散分布的肿瘤细胞，该研究未专门提及，仍可视情况纳入上述的着色模式；最后，关于线性的定义，必须是明确的、规则的线状着色，排除颗粒状着色。

（2）活检标本阳性的界定：由于胃癌HER2改良评分系统取消了活检标本着色比率的要求，给其结果的判断造成了困惑，如果1个肿瘤细胞满足膜高度阳性的判断，其标本是否就判为3+?该研究发现，在547例组织芯片标本中，所有判读不一致标本的阳性细胞数均低于5，故当阳性细胞数<5时，病理学家们对组织芯片标本的判读一致性最低。鉴于组织芯片标本与活检标本代表性类似，该研究提出一项经验性总结：胃癌活检标本判为阳性所需的细胞数最低为5，只有在膜阳性细胞数≥5时，才纳人1+到3+的考虑，即便是4个细胞完全而高度的膜阳性也只能评为0。

（3）放大倍数规则（the magnification rule）：由于观察者对染色强度的判断具有主观性，该规则把0到3+的4个评分依次与光学显微镜的不同物镜对应起来。如果在低倍镜（2.5~5×）下就能看到确定的膜阳性，则达到3+的染色强度；如果不能，换成中倍镜（10~20×）下能看到确定的膜阳性，则为2+的染色强度；只有在高倍镜（40×）下才能看到确定的膜阳性，则为1+的染色强度。然后结合膜阳性细胞比率或个数进一步判断，如果高倍镜下看不见膜阳性细胞或膜阳性细胞数量不够，评为0。显然，放大倍数规则比评分系统中描述性的文字“隐约可见、轻中高度”更客观且更具操作性（图2~5）。在明确了以上规则和注意事项之后，6位病理学家重新对547例组织芯片标本进行判读，所得结果的一致性极好（K=0.805）。

该研究的最后一步是对以上规则和流程进行多中心验证，德国有5个中心参与了这项验证，一共检测了447例胃癌标本，得出的HER2平均阳性率为22.8%。其中1个中心同时运用双色银染原位杂交（DSISH或BDISH）和IHC检测了152例标本，两种检测方法获得了很高的一致性，所有IHC3+的标本均有基因扩增，提示新的HER2IHC规则和流程可产生与原位杂交高度一致的结果。该研究设计较为严谨，完善并提出了新的胃癌HER2IHC判读规则和流程，并经较大样本量的验证获得满意结果，为胃癌HER2检测指南的制定提供了直接参考。



　　2011年发表的比利时胃癌HER2检测指南[14]沿用了Ruschoff等的研究结论，并认为10%的临界值也不适用于手术标本，因为某些病例尽管细胞着色比率低于10%不够评2+或3+，但其原位杂交切片却容易找到20个成簇扩增细胞而得到阳性结论。该指南建议活检标本和手术标本的IHC判读使用同一个临界值：5个或20个连续细胞，这一建议的应用价值有待探讨。该指南还提出，胃镜活检时在可疑区至少要取材6块，以提髙组织代表性，在挑选用于HER2检测的蜡块时，要选取腺腔形成最多的蜡块。



　　图2-5 手术切除标本“放大倍数规则”的免疫组织化学示意图；

　　图2 低倍镜下即可见确定的膜阳性，为3+的染色强度 低倍放大（左下角高倍放大）；

　　图3 中倍镜下才可见确定的膜阳性，为2+的染色强度 中倍放大（左下角高倍放大）；

　　图4 仅高倍镜下可见确定的膜阳性，为1+的染色强度 高倍放大；

　　图5 髙倍镜下未见确定的膜阳性，若全片膜阳性细胞比率<10%，评分为0 高倍放大。

　　二、原位杂交检测的标准化研究及讨论

　　目前有几种原位杂交方法可供选择，除了最常用的FISH法之外，近年来陆续有一些亮视野原位杂交方法问世，如显色原位杂交（CISH）、银增强原位杂交（SISH）及相应的双探针CISH和DSISH，这些亮视野原位杂交检测结果均可在普通光镜下判读。ASO/CAP乳腺癌HER2检测指南中提出：单探针FISH的HER2基因拷贝数>6.0/胞核为有扩增；<4.0/胞核为无扩增；4.0~6.0/胞核为扩增不确定。双探针FISH的扩增比值（HER2：CEP17）>2.2为有扩增；<1.8为无扩增；1.8-2.2之间为扩增不确定。对于双探针FISH不确定病例，中国的乳腺癌HER2检测指南（2009版）[18]有更详细的建议：若HER2：CEP17比值在1.8~2.2之间，再计数20个细胞的信号或由另一位分析者计数，若仍为临界值，应在检测报告中注明，也可重复进行FISH或IHC检测。在胃癌中，Hofmann等[6]分析了168例胃癌及胃食管交界癌的FISH和IHC结果，取HER2：CEP17比值≥2.0为有扩增时，FISH和IHC检测的符合率达93.5%。

在接下来的ToGA试验中，亦采用2.0为FISH基因扩增的临界值[11]，结合改良后的IHC评分标准，对3665例患者进行了HER2状态的检测和评估，筛选出810例HER2阳性（IHC为3+或FISH有扩增）患者，随机指定其中的298例患者接受曲妥珠单抗联合化疗，该组患者中位生存时间比只接受化疗的对照组延长了2.7个月（P=0.0046），可以认为该研究使用的HER2评判标准与临床试验相关性良好。Ruschoff等[16]在研究中同时运用DSISH（BDISH）和IHC检测了152例标本，取2.0为基因扩增的临界值，发现所有IHC3+的标本均有基因扩增，提示IHC和原位杂交的相应评判标准能产生一致性很高的结果。比利时胃癌HER2检测指南[14]建议：所有病例均要求做IHC和原位杂交，原位杂交的判读应参照IHC以避免遗漏有扩增的区域，在可疑扩增区至少计数20个相邻、不重叠的肿瘤细胞，如果HER2：CEP17比值在1.8~2.2之间，在另一可疑扩增区再计数40个满足上述条件的细胞，最终比值为2.0为有扩增，以此作为挑选曲妥珠单抗治疗患者的惟一标准。

　　RUschoff等[16]总结了胃癌与乳腺癌HER2检测上的差异（表2），同时指出，由于胃癌异质性较乳腺癌更为明显，亮视野原位杂交方法可能比FISH更具优势[16，19]，国内已有研究证实了这点[20]。ToGA试验发现，若把FISH作为首选方法来筛选病例，只有少数IHC 3+病例会漏选，但会出现较多靶向治疗不敏感病例。故检测到HER2基因的扩增不足以有效发现那些耙向治疗显著受益的患者，IHC 3+/FISH阴性的患者也能很好受益。有研究者认为，在胃癌中IHC的预测价值比FISH要高[16]，这仍然与胃癌的异质性有关，因为在IHC染色切片上，异质性区域可结合全片分析，而FISH在暗视野100×物镜下观察，难以在同等时间内全面把握切片信息。因此IHC可用于胃癌患者HER2耙向治疗的初步筛选，FISH不能作为首次或惟一决定是否适合该治疗的检测。IHC 3+患者可在医师推荐下直接使用曲妥珠单抗治疗；IHC 2+患者需再行FISH检测，IHC 2+/FISH阳性患者使用曲妥珠单抗治疗仍可受益；对于IHC（0或1+）/FISH阳性的患者，曲妥珠单抗治疗效果未获肯定[11，21]，还需更多研究数据来综合判断。



　　三、展望

　　随着个体化治疗的快速发展，分子病理检测将逐渐成为病理科的常规项目，其诊断结果将直接指导患者的治疗并提示患者的预后，这就要求我们重视分子病理诊断的质量控制和标准化。在乳腺癌中开展了数年的HER2检测，已成为推动临床病理诊断质量控制的重要力量。胃癌中HER2的检测才刚刚起步，就已经有诸多经验教训可借鉴。从组织的处理到HER2的检测流程，再到结果的判读，均可在乳腺癌HER2检测指南基础上进行合理的摸索和调整。以上一些研究已为胃癌HER2检测的标准化提供了许多参考，从中我们也能发现面临的问题，比如胃癌的异质性、FISH预测价值的降低等。HER2状态的准确检测和判读需要标准化方法的支持，也需要足够的临床治疗资料来验证。胃癌HER2标准化研究的最终目的是使患者得到最有效的治疗，真正成为个体化治疗的受益者。

xiaofeng

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