肿瘤浸润淋巴细胞在乳腺导管原位癌中的预后意义 （主要内容翻译）

阳光56

摘要

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在浸润性乳腺癌中具有评估预后的价值，并且评估指南已经发布。本研究旨在评价TILs的评估方法及其对乳腺导管原位癌（DCIS）的预后意义。我们采用两组临床诊断为DCIS的H＆E染色切片，对训练组（n = 150，纯DCIS）和验证组（n = 666，包含534例纯DCIS和132例DCIS伴浸润性乳腺癌）进行了评估。在7种不同的评分方法中，与导管基底膜接触的或与之距离1个淋巴细胞厚度的TILs与临床结果具有最显著的相关性和最高的一致率[组间相关系数= 0.95]。随着TILs与DCIS距离的增加以及间质TILs所占比例增高，对导管旁TILs的评估变得越发困难，并显示出比接触型TILs更低的一致率。TILs热点及淋巴滤泡无预后意义。在纯DCIS验证组中，密集TILs与年龄较小、有临床症状、体积较大、核级较高、粉刺状坏死、雌激素受体阴性以及较短的无复发间期相关（P = 0.002）。在多变量生存分析中，保守治疗的患者中，密集的TILs是较短无复发间期的独立预测因子。伴浸润癌的DCIS相比于单纯DCIS可见更密集的TILs（p=9.0×10-13）。密集TILs是DCIS的独立预后变量。接触型TILs为预后评估提供了一个可重复的方法，或可用于指导临床治疗。

前言

随着乳腺X线筛查的应用，乳腺导管原位癌（DCIS）的发病率显著上升[1,2]。同时，随着保乳手术的运用在乳腺癌治疗中不断增加，人们需要有效而可靠的标志用于预测疾病复发和进展，以对患者进行风险分级。将DCIS的复发率和临床进展率（进展为浸润癌）与乳房切除术、外科再切除或强疗程放疗的使用率进行比较，可发现由于缺乏精确的风险分级而导致的过度治疗[3]。现阶段应用基因分子标志对DCIS进行分类以提供恰当的个体化治疗方案尚具有挑战性[4-9]。

肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）标志着适应性免疫应答对肿瘤的抵御，也是肿瘤免疫治疗的基石[10,11]。在先前对浸润性乳腺癌的研究中，密集TILs主要在三阴性乳腺肿瘤中能增强化疗效果并产生较好的预后[12,13]。在阐明TILs对于浸润性乳腺癌预后的意义以及其潜在的临床应用后，发布了TILs评估指南[14,15]。然而，浸润性乳腺癌中推荐的TILs评估方法未必适用于DCIS，因为在DCIS中并非所有间质TILs直接接触恶性导管，且对DCIS周围间质的识别和定义非常模糊。尽管已报道了TILs在DCIS中的作用[5,16]，但在DCIS的研究中，应用浸润性癌的指南评估TILs并未发现与临床预后的相关性[15,17]。这可能是由于TILs在浸润性癌和DCIS中性质和分布的差异以及非最优的评估方法导致。本文使用了大样本量的DCIS确诊病例及长期随访数据，旨在针对DCIS建立一种可靠的、可重复的、对预后和复发具有重要意义的TILs最优评估方法。

方法（主要内容）

所有病例分成两组：训练组和验证组，训练组包括150例单纯DCIS，验证组又分为单纯DCIS组、DCIS伴浸润性乳腺癌组。
H＆E染色的切片（4-5um厚）经高分辨率切片扫描仪（PANNORAMIC 250 FLASH III, 3D-HISTECH）扫描，分析软件Pannoramic Viewer Software program，version 1.15.4。所有可识别的单个核炎症细胞，包括淋巴细胞和浆细胞均计数，分叶核细胞除外。

TILs的评估方法细节见表1和图1.

表1.  DCIS中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的评估方法和参数

图1. TILs的评估参数。a.接触型淋巴细胞（×40）被定义为接触基底膜或距离基底膜1个淋巴细胞厚度之内的淋巴细胞（黄色箭头）；右下为接触型TILs的放大视野。b. 距离导管0.2 mm, 0.5 mm和1 mm之内的TILs的评估。c. TILs热点（黑色虚线圈出的病变中大量淋巴细胞聚集）的评估。

结果

本研究包含两组病例。训练组：包含150例单纯DCIS病例，由3名观察者使用7种不同的评分方案进行评分；验证组：包含666例病例，其中包括534例单纯DCIS和132例DCIS伴浸润癌，由2名观察者对接触型TILs和间质TILs进行评分。

训练组

3名观察者使用不同方法对TILs进行评估的一致率见补充表3。最高的观察者间一致率见于对接触型TILs的评估（组相关系数=0.96）；最低的一致率见于对间质TILs占比的评估（组相关系数=0.79）——该方法是浸润性乳腺癌的推荐评估方法。

DCIS周围不同区域平均TILs计数见补充表4。从接触DCIS导管的区域到距离DCIS导管1 mm距离的区域，平均TILs计数由37个细胞/DCIS导管上升到482个细胞/DCIS导管。最大热点密度从20至6000个细胞不等，而间质TILs占比则为1-65%不等。从接触区到距离0.2 mm的区域，平均TILs密度上升4倍，而从距离0.2 mm到距离0.5 mm的区域则仅上升2倍，从距离0.5 mm到距离1 mm的区域仅上升1.5倍。未见无TILs的病例。接触TILs与其他局部区域的TILs显示出正相关性（补充表5）。最高的相关性见于接触TILs和距离0.2 mm的TILs之间（Spearman系数=0.854，p=1×10-13）。距离导管越远的区域，其TILs计数与接触TILs的相关性越小。

53%的病例于接触区可见密集TILs，而距离导管0.2、0.5和1 mm的区域，可见密集TILs的病例分别为57%、59%和65%。密集TILs热点见于31%的病例，而密集间质TILs则见于49%的病例。仅31例可见淋巴滤泡（21%）。不同局部区域可见密集/稀疏TILs的病例占比、各处发生局部复发的病例占比以及二者与无复发期的相关性见表2。密集和稀疏TILs的实例见图2。

发生局部复发的DCIS中，有60%的病例在任何用于评估的局部区域（接触区、距离0.2 mm、0.5 mm、1 mm的区域或间质TILs百分比）均可见密集TILs。仅有5例（15%）发生局部复发的病例可见淋巴滤泡形成。不同区域的密集TILs浸润与较短的无复发期存在显著的相关性（接触型TILs, p=4.7×10-6; 距离0.2 mm的TILs, p=0.001; 距离0.4 mm的TILs, p=0.002; 距离1 mm的TILs, p=0.001）。间质TILs密度也与较短的无复发期存在相关性，但其显著性小于用距离恶性导管远近而定义的密集TILs（p=0.02）。TILs热点或淋巴滤泡形成与肿瘤复发之间无显著的相关性（分别为p=0.09和p=0.15）。单变量生存分析的结果详述见表2。不同部位TILs密度和无复发期的Kaplan-Meier生存曲线见补充图2。

表2.  Frequency of TILs density in different topographic areas and their association with outcome in terms of recurrence-free interval in the training set
图2. DCIS周围的接触TILs密度。a. 密集浸润，接触TILs的平均细胞数大于20个细胞/DCIS导管。b. 密集接触型TILs的高倍镜视野。c.疏松浸润，每处病变中接触TILs的平均细胞数在20个细胞以下/DCIS导管。

验证组

在验证组中评估接触型TILs，两名观察者的一致率与训练组相当（组间相关系数=0.95）。以20个细胞/DCIS导管作为分界点对接触型TILs进行的二分法评价显示，239例（45%）可见密集TILs浸润而55%可见稀疏TILs浸润。

TILs密度与其它临床病理学参数的相关性

与密集的接触型TILs相关的侵袭性肿瘤生物学行为参数包括：较年轻的年龄、临床表现出症状和较大的肿瘤体积。仅8例（14%）低核级病变可见密集TILs，而中等核级和高核级病例中分别有33%和54%可见密集TILs（p=1.1×10-9）。1/2伴粉刺状坏死的病例（50%）可见密集TILs，而在无粉刺状坏死的病例中仅32%可见密集TILs（p=0.00009）。约2/3伴Paget's病的DCIS病例（69%）可见密集TILs浸润，而无Paget's病的病例中仅46%可见密集TILs浸润（p=0.025）。72% ER阴性DCIS可见TILs浸润，而ER阳性病例中仅36%可见高密度TILs（p=1.04×10-10）。

此外，密集TILs可见于80%伴浸润的DCIS中，而在分级准确的单纯DCIS中为54%（χ2 = 51.29, p = 8.96 × 10−13）。该相关性也见于以接触TILs作为连续变量进行评估的情况下（p = 3.14 × 10−12）（补充图3）。TILs密度与多种临床病理学参数的相关性总结于表3。

表3. Correlation between TILs density (based on mean number of touching TILs with cutoff 20 cells/DCIS duct) and clinicopathological parameters in the validation set


验证组中单纯DCIS病例的患侧局部复发率为11.8%（n=63）。39/239例复发病例（总复发病例的62%）可见密集TILs浸润，24/295例（总复发病例的38%）复发病例可见稀疏TILs浸润。实施保乳手术的患者中，24/80例（56%）伴密集TILs浸润的患者局部复发，19/139例（44%）伴稀疏TILs浸润的患者局部复发。评估ER的状态发现，伴密集TILs浸润的ER阳性DCIS中有22例发生复发（n=114），而伴稀疏TILs浸润的ER阳性DCIS中有40例发生复发（n=198）。在ER阴性DCIS患者中，14/83例伴密集TILs浸润的病例发生局部复发，而仅1/33例伴疏松TILs浸润的患者发生局部复发。

        若将TILs分为三类（三级分类系统）：无/极少TILs浸润（接触型TILs平均细胞数/DCIS导管≤5）、疏松TILs浸润（6-20个细胞/DCIS导管）和密集TILs浸润（＞20个细胞/DCIS导管），则其复发率分别为1/37例（全组的3%，全部复发病例的1.5%）、23/258（全组的9%，全部复发病例的36.5%）和39/239（全组的16%，全部复发病例的62%）。

        使用TILs二级分类系统（密集/疏松）进行单变量生存分析时，密集TILs与较短的无复发期之间呈统计学显著相关。该相关性见于对全组病例的分析（p=0.002）或见于对保乳手术患者的分析（p=0.001）。考虑ER状态时，无论在ER阳性病例（p=0.011）还是在ER阴性病例（p=0.025）中，密集TILs浸润均与较短的无复发期相关。对全组病例（p=0.0001）以及对保乳手术病例（p=0.004)进行分析时，使用第二名观察者的评分进行单因素分析，能够得到TILs与复发之间的显著相关性，这支持了使用接触型TILs对临床结果进行预测的可重复性。此外，若使用两名观察者的平均分数进行分析，也可得到显著的相关性（p=0.002，全组病例；p=0.01，保乳手术病例）。

        同样的结果也可见于使用三级分类系统的单因素分析中：在全组病例（p=0.005）和保乳手术病例（p=0.004）中，密集TILs浸润与较短的无复发期存在相关性。不同临床病理学参数之间和TILs与无复发期之间的单因素分析结果以及Kaplan-Meier曲线分别见表4和图3。有趣的是，使用整体间质TILs占比进行评估时，TILs密度与无复发期之间无统计学上的显著相关性（p=0.117,全组病例；p=0.138,保乳手术病例）。其它临床病理学参数，包括患者年龄、肿瘤大小、核分级、粉刺状坏死、辅助放疗和ER状态的多变量Cox回归模型发现，密集接触型TILs是保乳手术患者较短无复发期的唯一独立因素（风险比=2.6，95%置信区间=1.41-4.7，p=0.002）（表5）。

表4. Univariate association of TILs and other clinicopathological parameters with recurrence-free interval
表5. Multivariate analysis results (Cox regression model)
讨论

目前，用于DCIS风险分级的临床病理参数如年龄、核级别、肿瘤大小以及粉刺状坏死尚不足以准确评估DCIS相关的复发风险[21,22]。DCIS中的TILs被认为在肿瘤的生物学行为和疾病进展中扮演着重要角色，然而在现阶段的临床实践中尚无共识性的指南来评估TILs。先前对DCIS中TILs评估的研究既没有对DCIS周围间质区域进行明确统一的定义，也没有确定DCIS预后分级的分界点。有些研究采用针对DCIS优化了的国际TILs工作小组指南（International Working TILs Group guidelines） [14]并对位于整体病变边缘以内的间质TILs占比进行评估[5,19]。Pruneri等[15]将DCIS周围的间质TILs定义为距离DCIS导管两个高倍镜视野之内的TILs，该定义已被其它作者采用[17,18,23]。据这些研究报道，TILs密度与DCIS复发之间缺乏相关性。而本研究中，我们评估了有长期随访数据的大量DCIS病例，并使用多种评分方案以确定最具可重复性和预后价值的评估方法。我们还提出了预后分级系统以利于日常工作中TILs在DCIS中的应用。

        训练组中的TILs评估显示，接触型TILs是DCIS中TILs评分的最优方法。该结论基于多种标准。首先，接触型TILs具有最高的观察者间一致率，无论观察者是否提前对方法学进行了讨论。第二，接触型TILs与其它局部区域的TILs呈正相关，因此能够代表整体病变区域内的TILs密度而无需在导管周围更广泛的区域评估TILs，这将节省评估时间。第三，接触型TILs的评估最为容易而快捷，无需精确测量距导管的距离或调整视野的比例和尺度。此外，评估接触型TILs还能避免对相邻导管之间重复区域的细胞进行计数而造成的统计混乱和多变。最后，接触型TILs与其它预后相关的临床病理学参数和DCIS临床预后（无复发期）之间存在最强的显著相关性。

        本研究中，无论是在训练组还是在验证组中，即使使用不同观察者的评分进行分析，接触型TILs与无复发期之间均存在显著的相关性。尤其是，无论在所有病例中还是在保乳手术的病例中，密集的接触型TILs与较短无复发期之间均存在相关性。重要的是，不管其他已知的肿瘤生物行为参数如何，接触型TILs是行保乳手术的DCIS患者术后复发的独立预后因子[24-27]。

        有趣的是，使用先前研究描述的TILs评估方法[5,15,17-19]对整体间质TILs占比进行评估发现，其与临床预后的相关性不仅一致率最低，还存在可变性。与浸润性乳腺癌中间质TILs的评价不同，较低的观察者内和观察者间一致性可能反映了在DCIS中评估间质TILs的主观性，即便对DCIS周围间质的区域进行预先定义也是如此。

        对浸润性乳腺癌TILs的研究报道了TILs和较好预后的相关性，尤其是在三阴性乳腺癌中，并支持了TILs与化疗的协同效应[12,13]。与之相反，本研究揭示，密集TILs在DCIS中不仅与DCIS更具侵袭性生物学行为的潜在风险相关，还与复发和进展风险的增高相关。Pruneri等[15]报告了密集TILs与侵袭性更高的DCIS之间的相关性，这支持了我们的结果。Hendry等[17]也报道，密集TILs与高级别、粉刺型、ER阴性和Her2阳性DCIS病变相关。尽管两项研究都未能揭示TILs密度和肿瘤临床预后之间的相关性，这可能是由于评估方法不同导致。最近的分子研究显示，密集TILs与侵袭性DCIS相关。伴密集TILs浸润的DCIS的拷贝数变异程度比低TILs密度的病变要高，这可能意味着密集TILs浸润的DCIS具有较高的免疫编辑能力，从而导致其更容易进展和复发[17]。此外，密集TILs浸润与高DCIS Oncotype DX评分相关[28]，这也支持了本研究的结果——TILs与DCIS临床结局不良相关。密集TILs浸润和预后不良的相关性也见于口腔、结肠、前列腺和胰腺的癌前病变[29,30]。

        有趣的是，DCIS中密集TILs浸润与较短的无复发期之间的相关性和ER表达无关。这可能意味着，免疫微环境和肿瘤细胞之间的交互作用对DCIS复发和/或疾病进展的影响与ER通路无关。对比伴浸润的DCIS和单纯DCIS的TILs密度可见前者TILs密度较高。该发现支持了炎症细胞能够影响DCIS进展和侵袭性的假说[5,16,31,32]。正如前期观测的结果[33,34]，在由粗针活检诊断DCIS的病例中进行TILs的评估和报告，有可能为这些病变提供一个存在浸润的预测参数。

        已有人推测不同免疫细胞亚群对DCIS生物学行为的作用。调节性T细胞（Tregs）在肿瘤对免疫系统的逃避中起到重要作用[35]。机体免疫应答稳态受Tregs调控，然而，过度抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤则会引起肿瘤进展这一相反结果[36]。高级别DCIS病变中可见高比例的FOXP3+细胞[19]。此外，被密集TILs包围的肿瘤细胞能够产生一些保护性蛋白以逃避机体的免疫系统。Thompson等[5]报道，伴密集TILs浸润的DCIS具有更多的PDL-1阳性细胞。两篇研究DCIS免疫微环境的文章都支持了这一观点[17,19]。尽管B淋巴细胞对肿瘤免疫和生物学行为的作用尚不明确，Miligy等[37]的一项小样本量DCIS研究发现B淋巴细胞的浸润与复发率的增高以及其他表征临床结果不良的参数相关。

        综上所述，使用接触型TILs作为DCIS切片H＆E染色中TILs的评估方法具有可重复性，能够预测肿瘤的生物学行为和疾病进展。在常规临床实践中应用此方法有助于对DCIS进行风险分级，以利改善个体化治疗。

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