活性氧 ROS 检测，实用 Tips - MedChemExpress

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活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS) 是生物有氧代谢过程中的副产物，是一类含氧并且性质活泼的物质的总称。ROS 的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端。在有氧呼吸中，线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给 O2，有一部分 O2 被还原，主要包括：超氧化物 (O2-)；过氧化氢 (H2O2)；单线态氧 (1O2)；羟基自由基 (HO.)；氢过氧自由基 (ROO.)；氧化物过氧亚硝基阴离子 (ONOO-) 等。

图 1. ROS 对细胞的影响

经典 HKSOX-1 系列

HKSOX-1 系列是对 O2- 具有极好选择性和敏感性的绿色荧光探针，可用于检测活细胞及体内的内源性超氧化物。HKSOX-1 (HY-130015) 为 HKSOX-1r (HY-130017) 升级版，可更好滞留在胞内，反映胞内信号。HKSOX-1m (HY-D1156) 则可特异性靶向线粒体，用于监测线粒体内O2-。

图 2. 受精后斑马鱼胚胎中内源性 O2- 的共聚焦成像[1]

经典 HKOC1 系列

HKOCl 系列是以铑为基础、特异性检测 HOCl 的荧光探针。HKOCl-3 (HY-130025) 为绿色荧光探针，而 HKOCl-4 (HY-130027) 为黄色荧光探针，具有更长的吸收波长和更好的 pH 稳定性。HKOCl-4m (HY-D1158) 特异靶向线粒体，可用于监测线粒体内 HOCl。

图 3. HKOCl-3 在多种细胞类型中检测内源性 HOCl[2]

ROS 染色实验简要流程 (以 HKOCl-3 为例 ）   

HKOCl-3染色液配制：

• 储存液的配制
  

用 DMSO 配制 10 mM 的 HKOCl-3。如用 203 μL DMSO 溶解 1 mg HKOCl-3。(注：HKOCl-3 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存)

• 工作液的配制
  

用预热好的无血清细胞培养基或 PBS 稀释储存液，配制成 1-10 μM 的 HKOCl-3 工作液。(注：请根据实际情况调整 HKOCl-3 工作液浓度，且现用现配)

• 细胞染色
  

悬浮细胞：离心收集细胞，加入 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。


贴壁细胞：弃去培养基，加入胰蛋白酶消化细胞。离心弃去上清后，加入 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。加入 1 mL HKOCl-3 工作液，室温孵育 30 分钟。400 g，4 ℃ 离心 3-4 分钟，弃去上清。加入 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。用 1 mL 无血清培养基或 PBS 重悬细胞后，使用荧光显微镜进行观察。
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参考文献

1. Jun Jacob Hu, et al. Fluorescent Probe HKSOX-1 for Imaging and Detection of Endogenous Superoxide in Live Cells and In Vivo. J Am Chem Soc. 2015 Jun 3;137(21):6837-43.

2. Hu JJ, Yang D, et al. HKOCl-3: a fluorescent hypochlorous acid probe for live-cell and in vivo imaging and quantitative application in flow cytometry and a 96-well microplate assay. Chem Sci. 2016 Mar 1;7(3):2094-2099.