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PART 1 CCK-8 简介
■ CCK-8 比色检测试剂盒 Cell Counting Kit-8，是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶的电子传递还原生成橙黄色的甲瓒 (Formazan)。而线粒体脱氢酶只在活细胞中存在，因此细胞增殖越多越快，则颜色越深；化合物的细胞毒性越大，细胞死亡量越多，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的甲瓒量) 和细胞数目呈线性关系。可通过酶标仪检测 430-490 nm 处的吸光度 (OD 值)，OD 值与细胞活力成正比，从而进行定量分析。
图 1. CCK-8 检测原理
图 2. 不同的细胞活力检测方法的优缺点
MCE CCK-8 产品一经推出，就受到了大家的信赖和一致好评，其助力发表的文章数量也在逐年增加。小 M 对发表文章的影响因子进行分析发现，CCK-8 助力发文期刊的影响因子分布较广，IF≥10 的共有 170+ 篇，5≤IF≤10 的共有 560+ 篇。
图 3. 左：MCE CCK-8 助力发表文章数年增长情况 右：不同影响因子文章数分布情况 (截止至 2022 年 9 月)
■ 高分文献验证其中最高分文章为中国科学院上海营养与健康研究所肖意传教授团队的 Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation，发表在 Immunity (IF 43.474)。
其他高分期刊还包括 Mol Cancer (IF 41.444)；Signal Transduct Target Ther (IF 38.104) ;Adv Mater (IF 32.086) 等。
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PART 2 CCK-8 的应用与案例
■ 客户验证 1---细胞毒性实验
为了验证筛选的 iZAK2 对衰老相关自身免疫的治疗作用，在小鼠原代 CD4+ T 细胞中检测了 iZAK2 的生物学功能，结果发现 iZAK2 处理不影响细胞活力或细胞质 DNA 积累。此外，iZAK2 可减轻老龄小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 相关自身免疫症状，以上结果都表明 iZAK2 是一种潜在的治疗衰老相关自身免疫性疾病的化合物。 图 4. iZAK2 对小鼠原代 CD4+ T 细胞活力的影响[1]
■ 客户验证 2---细胞活力检测 为了验证 poly (I:C) 预处理在体外抑制炎症反应和凋亡细胞死亡，用 CCK-8 法检测 H9C2 细胞中不同复氧时间和不同 poly (I:C) 浓度下的细胞活力，结果表明 poly (I:C) 预处理显著抑制了糖氧剥夺 (OGD) 诱导的炎症和凋亡反应来限制细胞死亡。 图 5. CCK-8 法测定不同复氧时间和 不同 poly (I:C) 浓度下的细胞活力[2]
■ 客户验证 3---细胞增殖测定 吞噬死亡细胞对于维持组织内稳态和预防炎症是必不可少的，经典理论认为这一过程主要是由巨噬细胞和树突状细胞等专职性吞噬细胞完成的。然而，越来越多的数据表明邻近的非专职性细胞在这一过程中也发挥了作用。虽然吞噬的死细胞可以为活细胞提供营养，但实验结果表明吞噬和没有吞噬死细胞的细胞在增殖方面并没有很显著的差异。图 6. CCK-8 法测定 NIH 3T3 细胞 吞噬死细胞前后的细胞活力[3]
PART 3 CCK-8 使用注意小贴士
小白: CCK-8 与细胞孵育后一般多久可以检测呢？ 小M: CCK-8 的培养时间一般为 1-4 h，但在培养 30 min 左右即可肉眼观察显色程度，最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。 小白: CCK-8 检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂会干扰检测，那我该如何确定我的待测溶液是否有还原性呢？ 小M: 将不含细胞的待测溶液孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，孵育 1-4 h 后，测定在 450 nm 处的空白吸光度。若测得的吸光度很小，则说明含有较少的还原剂，正式实验可以直接加入 CCK-8 进行检测；若测得的吸光度相对较大，则说明存在较多还原剂，正式实验时需去除培养基，将细胞洗涤两次后，再加入新的培养基和 10 μL CCK-8 溶液。
小白: 那培养基中含有酚红会对最终的实验结果有影响吗？
小M: 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
小白: CCK-8 和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，我该如何终止 CCK-8 反应呢？小M: 以下方法任选其一均可终止 CCK-8 反应：a). 在显色反应后，将培养板放置 4℃ 冰箱内；b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液；c). 每孔加 10 μL 1% (w) 的 SDS 溶液。 小M: 此外，需要注意！若培养时间较长，一定要注意蒸发问题。可以在 96 孔板的四周每孔中加入培养基或无菌 PBS，同时将培养板置于靠近培养箱内水源的地方，缓减蒸发。 小白：Get Get 新技能GET
参考文献 1. Wang Y, et al. Cytoplasmic DNA sensing by KU complex in aged CD4+ T cell potentiates T cell activation and aging-related autoimmune inflammation. Immunity. 2021 Apr 13;54(4):632-647.e9. 2. Chen E, et al. Poly(I:C) preconditioning protects the heart against myocardial ischemia/reperfusion injury through TLR3/PI3K/Akt-dependent pathway. Signal Transduct Target Ther. 2020 Nov 6;5(1):216. 3. Lu J, et al. Efficient engulfment of necroptotic and pyroptotic cells by nonprofessional and professional phagocytes. Cell Discov. 2019 Aug 6;5:39.
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