肠道微生物代谢物也能促癌 - MedChemExpress

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肠道菌群在人体健康中起着关键作用。新出现的证据表明，肠道微生物通过产生致癌代谢物参与肿瘤发生的进展。然而，潜在的分子机制在很大程度上是未知的......

提起肠道微生物，大家都会不约而同地想到菌群，研究较多的 “肠脑轴” 等等，也是近年来的热点话题。但其实不同的肠道微生物代谢物也能促进和预防癌症发展！
2024 年，Nature Cell Biology 在线发表题为“Gut microbial metabolite facilitates colorectal cancer development via ferroptosis inhibition”的研究论文。该研究发现从肠道微生物厌氧消化链球菌 (Peptostreptococcus anaerobius) 中提取的色氨酸代谢物，反式-3-吲哚丙烯酸 (IDA)，能够通过抑制铁死亡 (Ferroptosis)，促进结直肠癌 (CRC) 的发展[1][2]。

图 1. 肠道微生物代谢物对癌症发展的影响[1]。

罗伊氏乳杆菌 (L. reuteri) 释放色氨酸代谢物吲哚衍生物 I3A (Indole-3-aldehvde)。促进产生 IFNγ (干扰素 γ) 和 GzmB (表达颗粒酶 B) 的 CD8+ T 细胞，从而增强免疫检查点抑制剂 (ICI) 效果。色氨酸衍生物 IDA 源自 P. angerobius，通过抑制铁死亡促进 CRC 的发展。IDA 是 AHR 的内源性配体，直接调节基因 ALDHIA3。然后，该酶产生 NADH，并通过 NADH 介导的 CoQ 还原来促进 FSPI 调节的抗铁死亡。



肠道微生物代谢物对癌细胞铁死亡能有啥影响？这不，Cui 等人进行了筛选，确定了 IDA 可作为 RSL3 诱导的铁死亡的新型抑制剂。在 HT1080 细胞和 HT29 人结肠癌细胞中，只有 IDA 可以有效地抑制细胞铁死亡，而其他色氨酸衍生物并未表现出类似的实质性作用 (图 2B)。通过 C11-BODIPY 581/591 染色检测了细胞的脂质过氧化水平，发现 IDA 处理可显著抑制 HT29 细胞和 MC38 小鼠结肠癌细胞的铁死亡和脂质过氧化 (图中未显示)。
同时，在 HT29 3D 肿瘤球体和类器官中也观察到类似的结果：IDA 或 Liproxstatin-1 (Lipro-1)在很大程度上抑制了 RSL3 或 IKE (imidazole ketone erastin) 诱导的 HT29 肿瘤球体的铁死亡 (图 2C)。此外，通过异种移植模型，IDA 显著消除了脂质过氧化并促进了肿瘤的发展。其在 C57BL/6J 小鼠中也显示出对铁死亡的强大抑制作用，并促进 MC38 异种移植的进展 (图 2D)。

图 2. IDA 作为铁死亡抑制因子的鉴定[2]。

(A) 筛选方法示意图；(B) 用 RSL3 和 50 μM 色氨酸代谢物 (Tryptophan、IDA、IPA、3-Indole、IAA、IAld 和 ILA) 处理 24 小时的 HT1080 细胞或 HT29 人结肠癌细胞的细胞活力；(C) HT29 三维肿瘤球体和类器官的代表性图像，用 IKE (10 μM)、IDA (100 μM) 和 Lipro-1 (1 μM) 处理48小时；(D) C57BL/6J 小鼠中 MC38 荷瘤分析。

吲哚代谢物是 AHR (Aryl hydrocarbon receptor) 的天然配体。那么 AHR 就有可能参与 IDA 调节的铁死亡抑制，研究人员使用 AHR 拮抗剂 BAY-218 和 StemRe-genin 1  (SR1)，发现 AHR 拮抗剂显著地消除了 IDA 调节的铁死亡抑制 (图 3A)。同时，通过 CRISPR-Cas9 技术敲除 AHR (图 3B)，由于缺乏 AHR 表达，IDA 未能抑制铁死亡(图 3C-D)。此外，生物发光共振能量转移实验，证实 IDA 是 AHR 的内源性配体。IDA-AHR 的相互作用在 IDA 促进的抑制铁死亡过程中起着重要作用。

图 3. AHR 和 FSP1 是 IDA 抑制铁死亡所必需的[2]。

(A) 用 RSL3、IDA (50 μM)、BAY-218 (10 μM)和 SR1 (10 μM) 处理 24 小时的HT29 细胞的细胞活力。(B) 表达 sg-ctrl 或 AHR-sg 的 HT29 细胞的蛋白质印迹分析。(C-D) 用 RSL3 (5 μM) 和 IDA (50 μM) 处理指定时间的表达 sg-ctrl 或 AHR-sg 的 HT29 细胞的细胞活力 (C) 和脂质过氧化 (D)。(E) 对照细胞和 FSP1 KO HT29细胞的蛋白质印迹分析（左）；用指定浓度的 IDA (5-500 μM) 和 RSL3 (5 μM) 处理 24 小时后 HT29 FSP1 KO 细胞的细胞活力（右）。(F) 异位表达 FSP1 的 HT29 FSP1 KO 细胞的蛋白质印迹分析（左）；用 RSL3 (5 μM) 和 IDA (50 μM) 处理的具有异位表达 FSP1 的 HT29 FSP1 KO 细胞的细胞死亡（右）。(G) 每日 IDA (50  mg/kg) 的 nu/nu 小鼠中 HT29 WT 和 FSP1 KO 异种移植物的肿瘤图像。

FSP1 (Ferroptosis-suppressor protein 1) 可利用 NAD(P)H 催化还原性辅酶 CoQ10 的产生，作为细胞质膜蛋白保护细胞免于铁死亡。因此，构建 FSP1 KO 的 HT29 和 HT1080 细胞，以验证 FSP1 是否有助于 IDA 调节的铁死亡。如图 3E 所示，FSP1 KO 的 HT29 细胞在很大程度上消除了 IDA-AHR 轴的保护作用，而 WT HT29 细胞对 IDA 介导的铁死亡抑制有显著反应。同样，HT1080 细胞中 FSP1 的缺乏完全阻断了 IDA 的作用。而 FSP1 的异位表达挽救了这种表型(图 3F)。此外，给予 IDA 促进了 HT29 WT 细胞中的肿瘤发展，而 IDA 的作用在 FSP1 KO 细胞中基本消除 (图 3G)，表明 IDA-AHR 轴介导的铁死亡依赖于 FSP1。


FSP1 如何参与 IDA-AHR 介导的铁死亡作用？这其中又是否有其他基因参与调节呢？
为了解开疑惑，作者对 IDA 处理的 HT29 细胞进行了 RNA 测序。在 IDA 可能介导的基因中，ALDH1A3 是上调最多的 (图 4A)。RT-qPCR 和 Western blotting 分析证实，IDA 处理后，ALDH1A3 的信使 RNA 和蛋白质水平显著增加 (图 4B-C)，但在其他色氨酸代谢产物处理中没有显著变化，表明 ALDH1A3 可能是 AHR 的直接下游靶点。此外，ALDH1A3 表达降低会损害 IDA 抑制铁死亡的能力: ALDH1A3 的缺失显著抑制了肿瘤的进展，阻断了 IDA 促进的肿瘤生长 (图 4D)。
那二者又是如何结合发挥作用呢的？该团队寻找 ALDH1A3 启动子周围潜在的 AHR 结合位点。通过与共有的 AHR 结合基序 (GCGTG) 进行比较，发现在 IDA 处理时，内源性 AHR 在 ALDH1A3 转录起始位点 (TSS)上游约 100 bp 处对 R3 表现出强的结合亲和力，但对 R1 或 R2 不表现出强结合亲和力，表明在 IDA 激活 AHR 的情况下，AHR 在 ALDH1A3 启动子上募集 (图 4E)。

图 4. IDA 通过 AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10 轴抑制铁死亡[2]。

(A-C) HT29 细胞中 IDA (50 μM) 处理可能调节的 12 个主要基因的热图 (A)，处理后 ALDH1A3 的相对 mRNA 水平 (B) 和 ALDH1A3 表达的蛋白质印迹分析 (C)。(D) 每天 IDA (50 mg/kg) 的 nu/nu 小鼠中 HT29 WT 和 ALDH1A3 KO 异种移植物的肿瘤图像。(E) 人类 ALDH1A3 基因启动子区域的示意图，存在三个潜在的结合区 (R1-R3)，其中 R3 包含相同的序列。(F) 通过酶测定在 HT29 WT 和 ALDH1A3 KO 细胞中测量的 NADH 水平。(G) 补充 DMSO 或 NADH (10 μM) 后，用 RSL3 (5 μM) 处理的 HT29 ALDH1A3 KO 细胞死亡。(H) HT29 WT、ALDH1A3 KO 和 FSP1 KO 细胞中还原 CoQ10 与氧化 CoQ10 的相对比率。

此外，差异基因的基因本体 (GO) 分析发现，NADH 脱氢酶（醌/泛醌）活性的途径在 IDA 处理的细胞中特异性富集，这意味着 IDA-AHR 轴可能通过 NADH 介导的辅酶 Q10 还原促进 FSP1 调节的抗铁死亡作用。
体外实验表明纯化的 ALDH1A3 可以通过视黄醛产生 NADH。ALDH1A3 缺失显著降低了 NADH 水平，而在 ALDH1A3 KO 细胞中补充 NADH 可恢复铁死亡 (图4F-G)。在 ALDH1A3−/−。和 FSP1−/−细胞中还检测到较低比例的还原为氧化的CoQ10 (图 4H)。总之，这些数据表明 ALDH1A3 对于 IDA-AHR-FSP1-CoQ10 介导的铁死亡抑制至关重要。

本文介绍了肠道微生物代谢物 IDA 通过抑制铁死亡促进 CRC 的发展，机制上，IDA 作为 AHR 的内源性配体，在转录上上调 ALDH1A3 的表达，ALDH1A3 利用视黄醛作为底物产生 NAD，而 NADH 对于 FSP1 介导的还原性辅酶 Q10 合成至关重要。在体外和体内，AHR 或 ALDH1A3 的缺失在很大程度上消除了 IDA 促进的肿瘤发展。总之，研究结果表明，靶向 IDA-AHR-ALDH1A3 轴有望用于铁死亡相关的 CRC 治疗。

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IDA trans-3-Indoleacrylic acid (IDA) 是一种内源性代谢产物。IDA 是一种铁死亡抑制剂，可以通过 AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10 轴抑制铁死亡。

RSL3 RSL3 ((1S,3R)-RSL3) 是一种谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制剂 (铁死亡激动剂)，可降低 GPX4 的表达，诱导头颈部癌细胞的肥大性死亡。在 HN3 耐受细胞中，可增加 p62 和 Nrf2 的蛋白水平，使 Keap1 灭活。

Ferrostatin-1 Ferrostatin-1 (Fer-1) 是一种有效的、选择性的铁死亡抑制剂，抑制 Erastin 诱导的 HT-1080 细胞铁死亡 (EC50=60 nM)。Ferrostatin-1 是一种人工合成的抗氧化剂，通过还原机制来防止膜脂的损伤，从而抑制细胞死亡。

Liproxstatin-1 Liproxstatin-1 是一种有效的 ferroptosis 抑制剂，抑制铁死亡细胞死亡 (IC50=22 nM)。

BAY-218 BAY-218 (AHR antagonist 1) 是一种芳烃受体 (AHR) 拮抗剂。BAY-218 在 U87 胶质母细胞瘤细胞中具有 AHR 抑制活性，IC50 为 39.9 nM。BAY-218 可用于研究癌症或免疫反应失调的病症。

StemRe-genin 1 StemRegenin 1 是一种有效的芳香烃受体 (AhR) 拮抗剂，IC50 为 127 nM。 iFSP1 iFSP1 是 FSP1 (AIFM2) 的选择性有效抑制剂，EC50 值为 103 nM。iFSP1 可选择性地诱导过表达 FSP1 的 GPX4 敲除细胞发生铁死亡。iFSP1 可增强多种人癌细胞系对铁死亡诱导剂的敏感度，如 RSL3。

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参考文献：
[1] Zhang Q, et al. Microbial regulation of ferroptosis in cancer. Nat Cell Biol. 2024 Jan;26(1):41-42.
[2] Cui W, et al. Gut microbial metabolite facilitates colorectal cancer development via ferroptosis inhibition. Nat Cell Biol. 2024 Jan;26(1):124-137.