上期我们了解到在 SILAC 的实验中会用到同位素标记的氨基酸，而体内的代谢实验中是否也会有专门的同位素标记物的使用呢？今天就和 M 君一起来看下体内代谢实验中同位素标记物的应用吧
稳定同位素标记物是研究代谢的有力工具，越来越多地用于体内代谢研究，稳定同位素标记物在体内代谢研究中已经解决了许多生物学问题，如：代谢路径的确认、疾病机理的探索、新调控原理的发现、新治疗靶点及生物标志物的确认、新诊断方法的实施及个性化治等[1]。
稳定同位素标记物在代谢研究中这么重要，一般都有哪些同位素标记物的示踪剂呢?它们是如何区别并应用的呢？跟着 M 君继续来了解吧~
常用的示踪剂有稳定和放射两种同位素示踪剂，稳定同位素示踪剂因其标记方式灵活多样、示踪时长不受半衰期限制、给药方式多样及示踪通路研究较多等而受到体内代谢研究实验的追捧。
稳定同位素示踪剂应用较多的为含氘 (2H)、碳-13 (13C)、碳-15 (15N)、氧-18 (18O) 等的同位素标记物，全标记的示踪剂具有作为全局示踪剂的潜力目前广泛用于代谢研究中，它们可以一次将标记转移到多个下游途径中，研究多个通量，如全 13C 标记的葡萄糖 (D-Glucose-13C6) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-13C5) 等，通过给药体内，可分析下游代谢产物，找出上下游代谢途径及其它们的内在关系、代谢产物的组成和含量等，甚至研究细胞代谢的动态变化。
图 1. R. solanacearum F1C1 中通过13C标记确认OxPPP 和 Non-OxPPP 代谢途径[2]。
而特定位置标记的稳定同位素示踪剂因其在特定位置的同位素原子会转移到特定的代谢物中，对研究特定通路方面具有明显优势，目前也被广泛应用于体内代谢研究汇中，如有 [1-13C]-glucose 和 [1，2-13C]-glucose 在研究葡萄糖是参与的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 还是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途径中发挥了重大作用[2]。用 3 个 13C 标记的果糖 [1,2,3-13C or 4,5,6-13C]-fructose 示踪剂，通过使用在果糖标记在前 3个碳原子，后 3个碳原子的不同位置标记物，揭示了果糖主要通过甘油在小鼠小肠中分解为有机酸的过程[3]。
图 2. 小鼠接受未标记的葡萄糖和部分标记的果糖 (碳 1,2,3 或 4,5,6 标记)的 1:1 混合物。循环甘油，以及在较小程度上几种其他有机酸，优先由果糖的碳 4、5、6 形成。红线表示碳 1、2、3 与碳 4、5、6 的标记相等 (1、2、3 的 N = 4, 4、5、6 的 N = 3) [3]。
不同的同位素示踪剂有不同的用途，那我们要如何选择呢？M君带你进入了解大咖是如何筛选及后处理同位素的体内代谢实验的!
如何筛选稳定同位素示踪剂来进行体内代谢实验呢？Juan Fernández-Garcí 教授等人对用不同稳定同位素做体内示踪实验的文献做了汇总，并总结了体内示踪实验总流程图，具体的过程如下：
1. 根据实验目的选择合适的稳定同位素示踪剂，示踪剂的选择必须有某个代谢途径来驱动，这些代谢途径的研究正好解决目前实验需要解决的生物学问题，然后用不同方法掺入模型生物体内，如输液/注射、灌胃/饮食等。
2. 根据实验目的选择，从受试者身上收集组织或者血液样本。
3. 对收集的样本代谢物的提取，如组织样本处理时要控制好温度和时间，减少对代谢的扰动。
4. 上机检测。根据提取的代谢物，使用质谱 (MS) 或者核磁 (NMR) 等分析技术，检测代谢物。
5. 数据分析。根据示踪剂与下游代谢物的检测情况，评估不同代谢物的同位素富集。根据所检测代谢物数据分析，依据系统代谢模型，确认代谢物状态及途径。
图 3. 体内示踪实验总流程图[1]。
此时稳定同位素在体内代谢研究中的应用已完全掌握了吧？下面 M 君给出一点小Tips:
在筛选稳定同位素示踪剂做体内代谢实验时，建议参考以下几点建议：
1. 同位素标记物的稳定性：稳定同位素标记物要在体内稳定存在，且不干扰生物体的正常代谢过程。
2. 同位素标记物的代谢途径：在体内代谢实验中，需了解所选择稳定同位素标记物的代谢途径和产物。标记物要被完全代谢，不干扰实验结果。
3. 同位素标记物的使用方法：在体内代谢实验中，需了解如何在体内掺入稳定同位素标记物及实验方法，后续的样品处理和数据分析。
4. 同位素标记物的成本：标记物价格比非标记物要贵些，要权衡考虑实验数量和实验周期等因素，参考实验预算，以保证实验顺利完成。
小 M 已和您共同学习了稳定同位素在体内代谢实验中的应用，您是否也正好在做类似的实验呢？可以浏览下 MCE 的稳定同位素标记物，你想要的我都有！
D-Glucose-13C6
13C 标记的葡萄糖体内代谢实验中使用最多
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D-Glucose-13C6, d7
13C 标记的葡萄糖体内代谢实验中使用最多
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D-Glucose-13C
13C 标记的葡萄糖体内代谢实验中使用最多
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D-Glucose-13C2-4
13C 标记的葡萄糖体内代谢实验中使用最多
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D-Glucose-13C-4
13C 标记的葡萄糖体内代谢实验中使用最多
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L-Glutamine-13C5
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Glutamine-5-13C
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Glutamine-1-13C
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Glutamine-13C5,15N2
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Glutamine-15N2
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Glutamine-15N
13C 和 15N 标记的谷氨酰胺在体内实验中也经常用到
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L-Serine-13C3
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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L-Serine-13C
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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L-Serine-15N
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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L-Serine-1-13C
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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L-Serine-13C3,15N
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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Glycine-15N
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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DL-Alanine-13C-1
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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Palmitic acid-13C16
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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L-Proline-13C5
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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Lactate-13C sodium
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到
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Propanoic-13C3 sodium
13C 和 15N 标记的氨基酸、脂肪酸等在体内实验中也常常用到。
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参考文献：
[1] Fernández-García J, Altea-Manzano P, Pranzini E, Fendt SM. Stable Isotopes for Tracing Mammalian-Cell Metabolism In Vivo. Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):185-201
[2] Jyoti P, Shree M, Joshi C, Prakash T, Ray SK, Satapathy SS, Masakapalli SK. The Entner-Doudoroff and Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways Bypass Glycolysis and the Oxidative Pentose Phosphate Pathway in Ralstonia solanacearum. mSystems. 2020 Mar 10;5(2):e00091-20.
[3] Jang C, Hui S, Lu W, Cowan AJ, Morscher RJ, Lee G, Liu W, Tesz GJ, Birnbaum MJ, Rabinowitz JD. The Small Intestine Converts Dietary Fructose into Glucose and Organic Acids. Cell Metab. 2018 Feb 6;27(2):351-361.e3.
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