在蛋白生物学的世界里，Co-IP 是解锁蛋白质“朋友圈”的神兵利器。但如果操作不当，它可能会变成实验室里的“尴尬社交”。今天，我们就来聊聊如何让你的 Co-IP 实验优雅又高效，轻松把蛋白“拉下场”！
01什么是 Co-IP？
免疫共沉淀 (Co-Inmunoprecipitation, Co-IP) 是一种利用目标蛋白特异性抗体与蛋白 A/G 磁珠或琼脂糖珠结合，从而沉淀目标蛋白及其相互作用蛋白的技术 [1-4]。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图 1. Co-IP 原理图。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]X：诱饵蛋白，Z：靶标蛋白
简单来说，就是利用抗体捕捉目标蛋白，看看有哪些其他蛋白会“搭顺风车”来到沉淀派对。这样我们就可以知道哪些蛋白质在细胞内是好朋友，经常一起 Hang out！
Co-IP 优势
可沉淀诱饵蛋白在天然组织细胞状态下存在互作关系的所有蛋白；
可沉淀整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；
可与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证；
分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体，结果更真实可靠。
Co-IP 分类
根据抗体来源、靶蛋白表达方式及样本类型等差异，Co-IP 可分为单克隆抗体/多克隆抗体 Co-IP、内源性/外源性 Co-IP、探索型/验证型 Co-IP 等类型。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在众多 Co-IP 分类方式中，内源性和外源性 Co-IP 就像科研界的双子星，不仅最常用，还各自闪耀独特的光芒！
小贴士：内源性 Co-IP：研究细胞或组织中自然表达的蛋白质。外源性 Co-IP：研究经过转染介导的外源表达系统来表达的蛋白质。
02 操作步骤与结果分析
Co-IP 实验流程
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图 2. Co-IP 实验流程图[1][5]。
Co-IP 流程 (以内源性 Co-IP 为例)[1]
01样本准备02固相介质准备03预清洗 (可选)将细胞裂解液或已预处理的样本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖进行预清洗，去除非特异性结合的蛋白质。
04免疫沉淀预清洗的样本中加入诱饵蛋白的特异性抗体，孵育促进抗体与蛋白结合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖继续孵育使其与复合物结合。
05洗涤洗涤复合物，去除非特异性结合蛋白。
06洗脱加入洗脱缓冲液，洗脱。
07分析
小贴士：
内源性 Co-IP 实验可选择[color=var(--weui-LINK)]
蛋白 A/G 磁珠或[color=var(--weui-LINK)]
蛋白 A/G 琼脂糖；外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等)，可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 [color=var(--weui-LINK)]
Anti-Flag 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]
Anti-HA 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]
Anti-c-Myc 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]
Anti-GST 磁珠等)，可一定程度增强丰度，减少 IgG 干扰。
Co-IP 结果解读
随着 Co-IP 实验流程的完成，我们终于手握初步数据！那么，这些数据能告诉我们什么秘密？结果出来了，肿么分析呢？
以下让小 M 通过两个经典案例，来看看如何解读实验结果，挖掘蛋白质相互作用的“朋友圈”！
内源性 Co-IP 结果解读
图 3. 内源性 ANT2 和 GRP75之间存在相互作用[6]。
外源性 Co-IP 结果解读
图 4. 外源 GRP75 可增强 ANT2-UCP1 的相互作用[6]。
03避坑指南：如何高效无误地进行 Co-IP?
样品准备：打好地基
拉蛋白就是请客吃饭，不给它们舒适的环境，谁都不愿来！
关注点 | 说明 |
| 温和的非离子型洗涤剂 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保护蛋白的天然结构，同时避免过强的去污剂 (如 SDS) 破坏蛋白相互作用。 |
| 样品准备时体系中的盐浓度范围在 150 - 300 mM 即可，过高可能“拆散”蛋白关系，过低可能导致背景蛋白“搅局”。 |
| 适当加入蛋白酶抑制剂，保护“核心成员”防止其被细胞内源性蛋白酶降解。 |
| 提前查阅文献了解蛋白“爱好”，重视蛋白修饰，如磷酸化、乙酰化等是否会影响复合物的稳定性。 |
| 提前验证目标蛋白表达水平，表达低可考虑优化转染或表达条件。 |
| |
抗体选择：定向输出
抗体选不好，后果你懂的……无论是拉下目标蛋白还是背景干扰，抗体都能“一锤定音”。 关注点 | 说明 |
| 选择经过 IP 验证的抗体，不可盲选。 |
| 根据 IP 抗体类型选择合适的同型对照抗体。 |
| 一抗和二抗的宿主种属要避开“同宗”，否则背景会抢戏。
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| 必要时进行预实验封闭抗体测试，验证磁珠/琼脂糖珠可与抗体有效结合。 |
| 太多可能造成非特异性沉淀，太少又可能拉不住目标蛋白。建议从优化实验中找到合适的浓度和用量。 |
| 如果抗体重链和目标蛋白大小相近，可选择轻链特异性二抗避免“撞车”。 |
实验设计：精准操作
Co-IP 实验不止“拉下”，其他环节也是“硬仗”。实验环节 | 说明 |
| 确定研究的蛋白质对，不胡乱邀请“不相干”的蛋白。
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| 实验组、IgG 阴性组、阳性组 (Input)。
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| 适当调整洗涤强度 (如低盐到高盐、去垢剂浓度等)，既要去除非特异性蛋白，又要保护靶蛋白复合物。
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| 用 Western Blot来做最后的“身份确认”，确保邀请到的都是真正的“贵宾”。 |
04经典问题和解决方案
如何让你的 Co-IP 实验更上一层楼？
每次实验的具体条件、操作步骤记得详细记录，这样才能在出现问题时找到原因，不断优化喔~
05小结
每一个 Co-IP 实验都是一场精彩的侦探游戏，我们不仅是执行者，更是策略家。这就是科研人的浪漫——在实验中找寻未知的兴奋，用结果揭示生命的奥秘。如果你觉得这篇干货满满的 Co-IP 秘籍有帮助，别忘了点赞、分享哦！期待在评论区看到你们的精彩讨论和宝贵经验！我们下期再见，继续解锁更多实验技巧，让科研不再有坑，只有惊喜！
参考文献：
[1] Lin JS, et al. Protein-Protein Interactions: Co-Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219.
[2] Tan L, Yammani RR. Co-Immunoprecipitation-Blotting: Analysis of Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2022;2413:145-154.[3] Lee C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 2007;362:401-6.[4] Tang Z, et al. Analysis of Protein-Protein Interaction by Co-IP in Human Cells. Methods Mol Biol. 2018;1794:289-296.[5] Burckhardt CJ, Minna JD, Danuser G. Co-immunoprecipitation and semi-quantitative immunoblotting for the analysis of protein-protein interactions. STAR Protoc. 2021 Jul 6;2(3):100644.[6] Chen X, et al. GRP75 triggers white adipose tissue browning to promote cancer-associated cachexia. Signal Transduct Target Ther. 2024 Sep 26;9(1):253.
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