乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶HER2基因状态对比分析

阳光56

　作者：刘媛媛，武莎斐，梁智勇，曾瑄（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科）
　　来源：中华病理学杂志
　　注：本文经《中华病理学杂志》授权发布，其他媒体转载或引用须经《中华病理学杂志》同意，否则追究法律责任。

　　【摘要】目的：探讨乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶HER2基因状态及其差异。方法：收集2012年5月至2015年6月间浸润性乳腺癌石蜡标本共150例，其中包括原发灶HER2基因扩增、无扩增及不确定3种基因状态各50例，且均有同侧腋窝淋巴结标本。以荧光原位杂交法（FISH）检测腋窝淋巴结转移灶的HER2基因状态，分析其原发灶与淋巴结转移灶之间HER2基因状态不一致性的发生率。结果：本组乳腺癌原发灶与其同侧腋窝淋巴结转移灶的HER2基因状态不一致率为20.7%（31/150）。原发灶HER2阳性的50例标本中，其淋巴结HER2阳性44例、不确定3例、阴性3例；原发灶HER2阴性的50例标本中，其淋巴结HER2阴性47例、不确定3例；原发灶HER2基因状态不确定的50例标本中，其淋巴结HER2阳性4例、阴性18例、不确定28例。HER2状态不确定组患者转移灶的HER2基因状态与原发灶HER2基因状态的差异，明显高于前两组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：乳腺癌原发灶与淋巴结转移灶之间的HER2基因状态存在一定的差异，对于淋巴结阳性的乳腺癌来说，必要时可再次检测同侧腋窝淋巴结，或原发灶与转移灶同时检测。对于原发灶HER2基因状态不确定的浸润性乳腺癌来说，检测腋窝淋巴结HER2基因状态，对于临床上抗HER2治疗方案的选择更有参考意义。

　　准确地进行乳腺癌HER2检测对于评估患者预后及确定有效的治疗方案，特别是选择针对性的化疗药和抗HER2的分子靶向药，具有重要的参考意义。一般来说，HER2检测多采用乳腺癌原发灶标本，也可原发灶或转移灶任选其一，其依据是原发灶基本可以反映转移灶中相关生物分子的状态[1]。但近来的一些研究显示，部分患者转移灶的HER2基因状态表现出与原发灶不一致的结果[2]。特别是有学者认为，当首次HER2检测其蛋白表达和基因状态均为结果不确定时，应再选择另一蜡块进行HER2检测，乳腺癌HER2检测指南（2014版）也建议复检[3]，以期最大限度地排除肿瘤异质性所导致的结果偏差。对于淋巴结阴性的乳腺癌来说，再次进行HER2检测只能选择来自原发灶的另一蜡块，而对于淋巴结阳性的乳腺癌来说，选用另一原发灶蜡块还是选用转移灶进行检测，却无明确的建议，而对于这类患者的临床处理来说，其原则明显不同于前者，因此这部分患者原发灶和转移灶HER2表达或基因状态的差异备受关注，有关这方面的研究数据也十分有限。我们拟对比分析乳腺癌原发灶与同侧腋窝淋巴结转移灶的HER2基因状态，并探索引起原发灶和转移灶HER2差异的可能原因，为临床选择相应的个体化治疗方案进一步提供依据。


材料与方法
　　1.材料
　　收集2012年5月至2015年6月在北京协和医院手术的乳腺癌原发灶以及配对的同侧腋窝淋巴结转移灶标本共150例。其原发灶蛋白表达均为免疫组织化学（IHC）2＋（抗体克隆号：4B5，购自Roche/Ventana公司）且均经荧光原位杂交（FISH）确认HER2基因状态，包括原发灶FISH阳性50例、FISH阴性50例、FISH结果不确定50例。取每例患者的腋窝淋巴结转移灶蜡块，连续切4 μm切片2张，贴于防脱载切片上，1张行HE染色，另1张用于FISH检测。本组标本中，包括髓样癌1例、浸润性小叶癌7例、浸润性大汗腺癌1例、浸润性癌13例、浸润性微乳头状癌4例、黏液癌1例、浸润性混合性癌3例、浸润性导管癌120例，患者年龄25～74岁，中位年龄48岁。

　　2.FISH
　　采用PathVysion探针试剂盒（购自美国雅培公司）进行淋巴结转移灶HER2基因状态检测。流程简述如下：常规烤片、脱蜡后，将待检测的切片置于ThermoBrite Elite自动FISH制片机（购自德国徕卡公司）内，依次进行预处理、加探针、封盖片、杂交以及杂交后的洗脱。切片经DAPI对比染色细胞核。在Ariol-DM6000全自动显微图像扫描分析系统（购自德国徕卡公司）中观察并分析结果。FISH判读标准依照乳腺癌HER2检测指南（2014版）[3]，简言之：计数≥2个以上浸润区内≥20个独立的、形态完整的、DAPI染色均匀的、同时具有红绿信号的癌细胞中HER2基因（橘红色）和第17号染色体着丝粒（CEP17,绿色）数，若红信号总数与绿信号总数的比值≥2.0 （HER2/CEP17≥2.0）或HER2平均拷贝数≥6.0，则视为FISH阳性。本组所有于2014年4月以前检测的乳腺癌原发灶HER2 FISH结果，均按此判读标准重新阅片。

　　3.统计学分析
　　应用SPSS19.0软件进行统计学分析；采用McNemar-Bower检验，P<0.05示差异有统计学意义。


结果
　　本组标本中，原发灶与同侧腋窝淋巴结转移灶HER2基因状态不一致率为20.7%（31/150）。原发灶HER2阳性的50例标本中，淋巴结HER2阳性44例、HER2不确定3例（3/50，6.0%）、HER2阴性3例（3/50，6.0%）；原发灶HER2阴性的50例标本中，淋巴结HER2阴性47例、HER2不确定3例（3/50，6.0%）；原发灶HER2基因状态不确定的50例标本中，淋巴结HER2阳性4例（4/50，8.0%；均为HER2/CEP17<2.0但HER2基因平均拷贝数>6.0）、HER2阴性18例（18/50，36%）、HER2不确定28例。经McNemar-Bowker检验，HER2状态不确定患者中，其转移灶HER2基因状态不同于原发灶的病例数明显高于HER2阳性和/或阴性患者，差异具有统计学意义（P＝0.03）。


讨论
　　对于原发灶HER2蛋白表达和基因扩增状态均为不确定的浸润性乳腺癌来说，选择另一蜡块进行复检，是目前学界的共识。根据乳腺癌HER2检测指南（2014版），一般首次多采用免疫组织化学的方法来检测HER2蛋白表达，若结果为不确定（IHC 2＋），则建议用FISH法进一步确认，若FISH为阳性，则视为HER2的最终结果为阳性；若FISH结果仍为不确定，则建议再选择另一蜡块进行复检，但复检标本的选择未做明确的界定，即可选择原发灶的另一蜡块，也可选择转移灶。但对于淋巴结阳性的乳腺癌来说，其临床处理原则明显不同于淋巴结阴性者，包括术后的放化疗及随访等[4]。所以，与淋巴结阴性乳腺癌相比，了解淋巴结阳性乳腺癌之转移灶的HER2状态，对于临床方案的制定，显得更为重要[5]。另外，据现有研究数据显示，无论是活检标本还是手术标本，尤其当首检结果为IHC2＋/FISH不确定而再计数下一组细胞或由另一阅片人复审后仍为FISH结果不确定时[6]，若复检选择原发灶的另一蜡块，则先后2次的结果差异极小，这也是我们探讨腋窝淋巴结复检可行性和必要性的原因之一。

　　El Nemr Esmail等[7]以IHC法检测了60例乳腺癌原发灶和同侧腋窝淋巴结转移灶的HER2蛋白表达，发现30%的病例其转移灶与原发灶结果不一致。提示在疾病进展过程中，生物分子的状态发生了改变，其治疗方案的选择是否应依据淋巴结的检测结果，有待于进一步的临床试验以获得相关的研究数据。Ieni等[5]以IHC和FISH分别检测了未经任何治疗的148例乳腺癌患者原发灶和同侧腋窝淋巴结转移灶的HER2蛋白表达和基因状态，4.72%的患者原发灶与转移灶HER2状态存在差异，其中由HER2阳性转为HER2阴性者4例（2.7%），由HER2阴性转为HER2阳性者3例（2.0%），提示原发灶和转移灶检测结果的不一致可能影响后续治疗措施的选择，建议同时检测原发灶和同侧转移灶[5]。我们以FISH法分析了未经治疗的150例乳腺癌原发灶和转移灶的HER2基因状态，对于原发灶HER2阳性的50例患者，转移灶HER2阴性者3例（6%）、HER2不确定者3例（6%）；对于原发灶HER2阴性的50例患者，转移灶HER2不确定者3例（6%），转移灶中未见HER2阳性病例；对于原发灶HER2基因状态不确定患者，转移灶HER2阳性4例（8%）、HER2阴性18例（36%）。原发灶HER2基因状态不确定患者中，大部分患者（44%）转移灶HER2状态得以明确，这对于治疗方案的确定至关重要。尽管不同研究结果显示，乳腺癌原发灶和转移灶中HER2蛋白表达程度和基因状态的一致性存在差异，但随着数据的积累，乳腺癌发展过程中HER2生物学行为的变化规律及其临床意义也将逐步被揭示。

　　由于乳腺固有的解剖学特征，绝大多数情况下确诊乳腺癌时均可首选手术切除，通常情况下进行原发灶的HER2基因状态检测，无论是否有淋巴结转移。各个乳腺癌HER2检测指南均推荐使用IHC或FISH法。对于原发灶HER2表达程度或基因状态不确定的患者来说，应采用另1种检测方法进行确认，即若首检为IHC法，则复检时采用FISH法；反之亦然。鉴于国内的检测现状，绝大多数医院首检都采用了IHC法，复检时采用FISH法。本组患者均为首检HER2结果为IHC 2＋，再经FISH法确认。因此我们对FISH结果不确定的50例标本未再行IHC复检，而直接以FISH法检测了其淋巴结转移灶的HER2基因状态，发现22例患者淋巴结转移灶的HER2基因状态不同于原发灶（18例FISH－、4例FISH＋），提示原发灶HER2蛋白表达和基因状态均为结果不确定时，检测其同侧腋窝淋巴结转移灶是可行的，对于其余28例淋巴结HER2基因状态仍为不确定的患者来说，是否应再以IHC进行确认（淋巴结转移灶通常未行常规IHC首检）或其他处理（如检测不同的淋巴结），尚待进一步探讨。另外，乳腺癌原发灶与转移灶HER2表达程度或基因状态变化的生物学意义有待于患者随访以及相关疗效数据的验证。

　　按照2014版乳腺癌HER2检测指南的FISH判读标准，在我们所分析的原发灶HER2阴性组和原发灶HER2阳性组标本中，分别新增了“结果不确定（equivocal）”的患者（HER2基因平均拷贝数4～6），这些不确定的标本若按2009版指南[8]则均会判读为HER2阴性，其原发灶和淋巴结转移灶均为HER2阴性，而依据2014版指南，则出现了4例阳性标本（HER2基因平均拷贝数>6.0），但HER2/CEP17均<2.0。如上所述，按照2014版的指南判读FISH结果，则增加了HER2不确定的标本数，即增加了复检的数量。对于本组标本，2次HER2检测结果（原发灶和淋巴结转移灶）不一致率为20.7%（31/150），略低于El Nemr Esmail等[7]的结果（30%）。较高的不一致率给予我们如下三方面提示：（1）肿瘤存在高度的异质性，对于治疗策略的选择有一定的参考意义，如针对原发灶和转移灶的HER2结果进行抗HER2治疗或评估疾病进程时是否有差异；（2）不排除样本量有限而导致的偏差；（3）按2014版指南判读，明显增加了复检后FISH结果仍为不确定的标本数，这与其他研究者近期报道的结果高度吻合[9,10,11]，也是目前在临床处理上最为棘手的一组患者，提醒研究者要特别关注由此类分子特征所导致的治疗方案和疾病进展等方面的异同。

　　我们对比分析了乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶HER2基因状态，着重探讨了目前令病理医师和临床医师最为困惑的IHC2＋而FISH复检结果仍为不确定的浸润性乳腺癌标本的复检问题，但因标本量及相关治疗和预后的随访信息有限，其确切的临床意义尚待大量研究结果的积累和完善。

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