非小细胞肺癌中CD24低表达延长患者生存期

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：张哲 吴育锋 汤虹 何振 王莉莉 王启鸣 买玲

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我们运用qPCR技术分析非小细胞肺癌组织和癌旁组织中CD24的基因表达情况，并运用Western blot检测其蛋白水平，回顾性分析其表达与肺癌临床病理参数之间的关系，并随访患者，分析其对肺癌患者预后的预测作用。

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资料与方法
　   1.一般资料
　　收集2008年12月至2010年1月本院病理诊断为非小细胞肺癌并进行手术的肺癌患者的肿瘤组织及正常癌旁组织标本33对。所有患者手术前均未做过化疗、放疗等其他抗肿瘤治疗。所有患者均随访至2015年8月30日，生存期为患者手术日期至由于肿瘤相关原因死亡日期或最后随访时间。

　　2.mRNA表达分析
　　共33对样本，首先用Trizol法提取总RNA，随后用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific公司）对提取的RNA进行逆转录合成cDNA，最后用ABI Prism 7000 real-time PCR系统对cDNA进行扩增。CD24上游引物：5'-CTCCTACCCACGCAGATT-TATT-3‘，下游引物：5'-TGAGACCACGAAGAGACTGG-3’。以GAPDH作为内参基因，上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCA-TTTG-3‘，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。其他待测基因引物序列参考文献[1,2,3]。采用qPCR的方法对33对非小细胞肺癌肿瘤组织与正常癌旁组织中各基因的mRNA表达水平进行检测。

　　3.肺癌组织CD24蛋白含量检测
　　以GAPDH作为内参，利用Western blot检测组织中CD24蛋白水平。抗体购自Santa Cruz公司，共33对标本。首先将收集的肿瘤组织与配对癌旁组织标本，加RIPA裂解液等提取总蛋白，上样，凝胶电泳，转膜封闭，加入一抗孵育，洗脱，二抗孵育，洗脱，显影。

　　4.数据收集与统计分析
　　应用SPSS 19.0统计软件分析，采用t检验分析肿瘤组织与正常癌旁组织中各基因的mRNA相对表达量的差异及Western blot定量分析蛋白表达，运用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线，以P<0.05为差异有统计学意义。

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结果
1.临床资料
　　患者年龄42 ～72岁之间。其中，男性23例，女性10例。鳞状细胞癌15例，腺癌18例。Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期8例；低分化11例，中高分化22例。有淋巴结转移的12例，无淋巴结转移的21例。

　　2.qRCR验证筛选基因
　　以GWAS分析结果为基础，选择具有表达差异的16个基因（CD133、CD24、CD34、OCT4、SOX3、PLAGL2、CD176、SALL4、CD105、TAZ、KIT、ABCG2、ALDH1、NANOG、SOX2、TERT）进行深入分析。采用qPCR的方法对33对非小细胞肺癌肿瘤组织与癌旁组织中各基因的mRNA表达水平进行检测。结果发现，本次样本中肿瘤组织CD24 mRNA的相对表达量显着高于癌旁组织（5.182±1.182比1.488±0.208），CD24 mRNA相对表达量在肿瘤组织中高于癌旁组织2.62倍（P＝0.002）。

　　3.CD24 mRNA相对表达量与临床病理参数及预后的关系
　　通过收集病史资料及电话随访，统计分析发现在非小细胞肺癌中CD24 mRNA相对表达量在不同年龄（P＝0.51）、性别（P＝0.56）、病理类型（P＝0.16）、分化程度（P＝0.99）、不同分期（P＝0.76）、有无淋巴结转移（P＝0.55）之间差异均无统计学意义。对患者的无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）与CD24 mRNA相对表达量进行相关性分析，发现肿瘤组织中CD24 mRNA的相对表达量与患者PFS、OS呈线性负相关（均P＝0.01）。

　　4.CD24蛋白表达水平与患者临床病理资料之间的联系
　　因为前期实验表明CD24 mRNA相对表达量与预后相关，为了验证其蛋白表达水平与CD24 mRNA的表达水平是否一致，我们利用Western blot检测肺癌组织与配对癌旁组织中的CD24蛋白水平，并利用Image J软件分析测定蛋白条带灰度值。肺癌组织中CD24蛋白表达水平是癌旁组织的2.46倍，P＝0.003（图1）。CD24蛋白与患者的年龄（P＝0.37）、性别（P＝0.65）、分期（P＝0.74）、分化程度（P＝0.58）、病理分型（P＝0.16）、是否有淋巴结转移（P＝0.26）之间差异均无统计学意义。

　　5.CD24蛋白表达与临床预后之间的关系
　　我们回顾性分析CD24蛋白表达量与患者PFS、OS的相关性，CD24蛋白表达水平与患者PFS呈线性趋势，Pearson相关系数r＝－0.360，总体相关系数95%置信区间为（－0.63，0.02），P＝0.04，二者呈线性负相关；其与患者OS呈线性趋势，Pearson相关系数r＝－0.394，总体相关系数95%置信区间为（－0.65，－0.06），P＝0.02，二者呈线性负相关。并根据CD24蛋白的表达量将患者分为高、中、低3组，利用Kaplan-Meier生存分析法进行生存分析并绘制的生存曲线，其中高、中、低三组的中位生存期分别为46.4、50.8和69.7个月。高表达组和中表达组的χ2＝4.337，P＝0.037，中表达组和低表达组的χ2＝3.938，P＝0.047，3条生存曲线差异有统计学意义，CD24表达低的患者中位生存期更长，进一步证实了CD24表达高的患者预后较差（图2）。



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讨论
CD24是近年来受到广泛关注的一种细胞黏附分子[1]。目前，CD24在肿瘤发生、发展及转移和预后的研究主要集中在卵巢上皮癌、乳腺癌[4]、前列腺癌、子宫内膜癌[5]、结直肠癌等恶性肿瘤。Surowiak等[6]发现卵巢癌CD24胞质胞膜表达患者OS和DFS明显缩短。Ma等[4]在人乳腺癌细胞株中，敲除CD24可以抑制细胞的活性和侵袭能力，并能增加对三苯氧胺的敏感性，从而延长细胞的寿命。CD24蛋白质在肝内胆管癌中表达增强，CD24阳性患者生存期明显缩短，多变量分析表明CD24是肝内胆管癌的一个独立预后指标[7]。但对于其在非小细胞肺癌中的作用研究尚少。

　　目前，对CD24的研究已成为肿瘤研究的热点。在前列腺癌细胞株中，CD24竞争性抑制ARF与NPM结合，导致ARF降低，MDM2水平升高，并降低p53和p53靶点p21/CDKN1A的水平。沉默CD24可以恢复75% p53突变体的一部分活性，包括最常见的p53 R273H突变。因此，推测CD24在肿瘤的发生过程中起到重要作用[2]。Thomas等[3]研究发现乏氧通过促进致癌转录因子低氧诱导因子（HIF）-1α在肿瘤细胞中的积累推动恶性肿瘤的进程，内源性HIF-1α聚集到CD24启动子区域诱导CD24 mRNA和蛋白水平的表达。HIF-1α或CD24表达的减少均会抑制原发性和转移性肿瘤的生长，HIF-1α剔除的癌细胞过表达CD24后，肿瘤细胞生长得到恢复，而CD24剔除的肿瘤细胞过表达HIF-1α后，肿瘤细胞的生长依然受到抑制，提示CD24作为HIF-1α转录调控蛋白和生物效应分子，是HIF-1α导致肿瘤迁移的效应器[3]。有学者在乳腺癌细胞中发现CD24除了促进与P-选择素的结合、与活化血小板和内皮细胞的附着结合、介导肿瘤细胞的血运转移外，还可以在脂质筏上与非受体酪氨酸激酶（c-Src）相互作用，影响肿瘤细胞的凋亡。大量的研究证实黏着斑激酶（FAK）的活化与肿瘤的生长和转移密切相关，在CD24表达时，FAK表现出磷酸化和稳定性降低，促进肿瘤的生长与转移。因此，FAK可能是CD24促进肿瘤细胞增殖与转移的一个重要介质，这种作用机制也可能是CD24促进肿瘤增殖和转移的原因[8]。研究证实CD24可导致MET信号级联放大扩增，最终导致子宫内膜癌细胞表达高水平的ATP结合盒转运蛋白，使更多的药物转运出细胞，行成化疗耐药，从而影响患者的预后[5]。

　　在本研究中，我们用qPCR方法检测了CD24 mRNA的相对表达量在非小细胞肿瘤组织与正常癌旁组织的差异，发现CD24 mRNA在非小细胞肺癌组织表达高于正常癌旁组织，用Western blot检测新鲜肿瘤组织与配对癌旁组织中CD24蛋白的表达量，CD24蛋白在肺癌组织中的表达量高于癌旁组织，与以往运用免疫组织化学检测CD24表达的结果类似，并且CD24的mRNA相对表达量及蛋白表达量在不同年龄、性别、病理类型、临床分期、分化程度的患者之间差异无统计学意义。通过随访并对CD24的mRNA相对表达量及蛋白表达量与患者PFS、OS进行相关性分析，CD24 mRNA相对表达量及蛋白表达量均与预后呈负相关，CD24表达量高的患者预后差。