宫颈细胞学意义不明的不典型鳞状细胞患者的分流筛查方法

阳光56

　　作者：金蓉蓉，马红伟，陈天羽，张智弘（南京医科大学第一附属医院病理科）
　　来源：《中华病理学杂志》
　　注：本文经《中华病理学杂志》授权发布，其他媒体转载或引用须经《中华病理学杂志》同意，否则追究法律责任。

　　宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率居妇科肿瘤第2位。据WHO统计，全球每年有高达约53万新发病例，并有将近27.5万的患者死于宫颈癌[1]。我国是宫颈癌高发国家，发病率约14.6/10万。大量临床研究表明，宫颈癌的发生和患者过早、过多的性生活以及缺乏良好的卫生习惯有关，但感染人乳头状瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）是导致宫颈癌的最主要原因。自从20世纪50年代以巴氏涂片为基础的宫颈细胞学检查作为主要手段应用于宫颈癌筛查以来，宫颈癌的发生率和病死率已明显下降[2]。目前宫颈细胞学检查报告系统采用The Bethesda System（TBS）分类法，其中意义不明的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）是最常见的宫颈细胞学异常结果，其组织病理学诊断结果差异大，从炎性病变到宫颈癌的诊断均可见，导致临床对ASC-US患者的处理存在分歧。美国阴道镜宫颈病理学会（American Society for Colposcopy and Cervical pathology，ASCCP）建议以下3种处理方法：（1）重复细胞学检查；（2）立即阴道镜检查；（3）高危型HPV检测分流管理（即对阳性者立即行阴道镜检查，对于阴性无临床症状患者可随访）。细胞学随诊可能漏诊宫颈上皮内瘤变（CIN），并且面临失访率高的困境；立即阴道镜检查可能导致过度诊断；HPV检测分流管理效价比高，有效减少阴道镜检查，节省医疗资源，同时还降低CIN2及以上病变的漏诊率，但大多数研究结果表明HPV检测作为ASC-US分层管理手段仍存在着特异度低、阳性预测值不理想等问题[3]。因此一些生物标志物及特殊分析方法被应用于临床，以便在宫颈细胞学轻度异常时更好地识别出高度病变。我们就高危型HPV检测、DNA倍体分析、免疫细胞化学标志物检测等ASC-US患者分流方法进行介绍。


　　一、ASC-US细胞学诊断标准及分流管理的意义
　　1988年美国国际癌症协会在马里兰州的Bethesda举行的会议上首次提出了TBS分类法，将其作为宫颈细胞学的诊断标准，先后在1991年和2001年进行了修正、完善。TBS分类法对不同程度的异常上皮细胞进行了归类，提出了ASC-US的诊断标准，即细胞的异常较反应性改变更明显，但未达到鳞状上皮内病变的程度，可以是增生活跃的良性改变或潜在恶性改变，不能对其进行明确分类。ASC-US的细胞形态学诊断标准为：（1）核面积大约为正常中层鳞状细胞核的2.4～3.0倍（大约35 μm2）；（2）核质比轻度增高；（3）核轻度深染，染色质分布或核形不规则；（4）核异常伴随胞质的强嗜橘黄色改变（“不典型角化不全”）。细胞学报告为鳞状上皮内病变的组织与高级别病变密切相关，而ASC-US是一种排除性诊断，是对存在病变危险的提示而不是异常病变的明确诊断，其组织病理学诊断包括正常宫颈、炎性病变、萎缩性改变乃至宫颈浸润癌[4]。值得关注的是，部分实验室将ASC-US视作“垃圾桶”，凡诊断不明确的病变均归入其中。ASC-US的报告率应控制在5%以下，其实验室诊断比例不应超过低度鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的2～3倍。

　　不同实验室的数据表明，宫颈细胞学检查诊断为ASC-US的患者进展为CIN2/3或浸润癌的几率约为5%～22%。Possati-Resende等[5]发现95例ASC-US患者中8.4%经组织学诊断证实为CIN2/3。Roche和Spicer[6]对ASC-US患者进行了2年随访，发现进展为CIN2/3的患者百分比为15%。目前，学者们对于ASC-US诊断的应用策略普遍存在争议，同时对于如何追踪这类人群并制定最佳治疗策略也存在疑问。在宫颈癌筛查中，如果对ASC-US这种诊断类型重视不足，将导致许多反应性改变被忽略，导致鳞状上皮内肿瘤的过度诊断，从而造成一部分高危患者的漏诊，增加不必要的阴道镜活检及过度治疗，给患者带来身心痛苦，甚至产生不良的远期影响。因此，对ASC-US进行分流管理，并不断改进分流方法，对于早期发现宫颈病变具有重要意义。
　　二、高危型HPV检测方法
　　宫颈癌病因学的研究证实高危型HPV持续感染是宫颈癌癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件。分子流行病学调查发现，99.8%的宫颈癌标本中有高危型HPV DNA存在。超过80%性生活活跃的妇女存在HPV感染，90%的感染可自行消退，10%的可持续感染，1%发展为宫颈癌。以上结果日益得到人们重视，并促进了高危型HPV检测的发展。迄今已发现150多种HPV亚型，其中13种是与宫颈癌发病有关的高危型HPV，包括HPV16、18、31、33等，其中HPV16和HPV18是最常见的致癌类型，二者在74%的宫颈癌中可检出，约70%的宫颈鳞状细胞癌及90%的腺癌由此2种类型引起。液基细胞学联合高危型HPV检测进行ASC-US分流与单纯液基细胞学方法具有相似的灵敏度，而对于CIN2及以上病变的特异度更高，肯定了高危型HPV检测技术在宫颈癌筛查中的应用价值。目前，得到美国食品和药品管理局（FDA）认证批准的高危型HPV检测技术包括3种HPV DNA检测技术（HC2高危型HPV检测、cervista HPV检测和cobas 4800 HPV检测）和1种HPV E6/E7 mRNA检测技术（Aptima HPV检测）。

　　1.HC2高危型HPV检测
　　采用信号放大法检测HPV DNA的二代杂交捕获技术，于1995年通过美国FDA批准可在临床使用，是最早应用于ASC-US相关研究的手段。HC2可检测出13种高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68）。Del Mistro等[7]比较了立即阴道镜、重复宫颈细胞学检查和HPV检测分流ASC-US的作用，发现HC2高危型HPV检测CIN2以上病变具有最高的灵敏度（92.3%）和特异度（78.6%）。在瑞典进行的一项筛查研究发现ASC-US病例中高危型HPV阳性率为50%[8]，高危型HPV阳性和阴性患者进展为CIN2/3的百分比分别为32.3%和2.0%。HC2高危型HPV检测和细胞学检查发现CIN2/3的灵敏度分别为97%和73%，特异度分别为59%和72%，且HC2高危型HPV检测的特异度随着年龄的增长而增高，50岁以上患者检测特异度为83%，30岁以下者则为34%。Ibá？ez等[9]利用HC2高危型HPV检测分流ASC-US患者，检出CIN2以上病变的灵敏度和特异度为97.2%和68.3%。因此，HC2高危型HPV检测可有效地对ASC-US患者进行分流，检出高级别病变，同时减少其他不必要的检查。

　　2.cervista HPV和cobas 4800 HPV检测技术
　　这2项技术分别于2009年、2011年通过美国FDA认证。cervista HPV检测技术不仅能检测传统的13种高危型HPV，还增加了HPV66；cobas 4800 HPV检测技术能特异度检测HPV16和18，同时也可检测包括HPV66在内的其余12种高危型HPV。在多项比较研究中[10]，cervista HPV检测与HC2高危型HPV检测具有相似的灵敏度和特异度，二者在ASC-US分流管理中的价值也类似。Lapierre等[11]对396例ASC-US患者分别使用cobas 4800 HPV和HC2高危型HPV检测方法分流，结果表明两者检出CIN2以上病变时具有相似的灵敏度（89.7%比93.1%）和特异度（66.7%比72.2%）。在ATH ENA试验中，cobas 4800 HPV检测技术的灵敏度和特异度分别为90.0%（95%CI＝81.5%～94.8%）和70.5%（95%CI＝68.1%～72.7%），与HC2高危型HPV检测具有较高的一致性。同时，cobas 4800 HPV也可以区分HPV16或HPV18感染者与其他高危型HPV基因型感染者。该方法目前尚未纳入ASC-US患者管理的临床指导方案。

　　3.高危型HPV E6/E7 mRNA检测技术
　　HPV E6/E7蛋白具有癌蛋白的特性，HPV感染基底细胞时，以游离状态存在于细胞内，保持持续潜伏感染的状态，此时E6/E7的表达量极少；随着HPV病毒大量增殖，E6/E7的表达量激增，因此高危型HPV的持续感染和E6/E7表达上调是宫颈癌发生的必要条件。Aptima HPV是2011年获得FDA批准的HPV mRNA目标扩增检测方法，主要用于检测液基细胞学中14种高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）的mRNA[12]。多项比较Aptima HPV与HC2高危型HPV检测对宫颈癌初筛作用的研究表明，两者发现CIN2以上病变的灵敏度相似，但Aptima HPV的特异度更高[13,14,15]。Castle等[16]对988例ASC-US患者同时行Aptima和cobas 4800 HPV检测，检出CIN2以上病变的灵敏度均为89.4%，而特异度分别为63.1%和59.3%。Arbyn等[17]检测了1 839例来自不同国家和地区的ASC-US患者，Aptima HPV与HC2高危型HPV检测发现CIN2以上病变的灵敏度分别为95.7%和93.8%，特异度分别为56.4%和46.8%，进一步提示在诊断ASC-US患者中高级别病变方面，Aptima HPV比HPV DNA有更高的特异度。
　　三、DNA倍体分析方法
　　2005年美国科学院院士Duesberg等[18]提出非整倍体可能是肿瘤发生的主要原因，肿瘤的产生是非整倍体自身催化的结果，大量的肿瘤病理及临床研究已经表明，细胞核DNA出现异倍体与肿瘤的恶性程度密切相关，所以检测细胞核的DNA倍体分析对宫颈癌的诊断、疗效评估、预后预测都具有重要的指导意义。病毒感染可以改变细胞内部调控机制（包括内复制和延缓细胞质的分化），从而使细胞进展为高级别不典型细胞，因此DNA倍体分析方法可以用于ASC-US患者分流。DNA倍体分析方法应用全自动扫描系统对宫颈脱落细胞进行DNA定量分析。DNA指数（DI）＝被测细胞DNA的吸光度（A）值/正常细胞DNA的A均值。目前诊断异常倍体细胞的标准为：DI＝0.8～1.2（正常细胞），DI ＝1.2～1.8（非整倍体细胞），DI＝1.8～2.2（4倍体细胞），DI＝2.2～2.5（非整倍体细胞），DI>2.5（倍体异常细胞）。出现以下3种情况之一诊断为DNA倍体异常：非整倍体细胞或4倍体细胞百分比超过10%；出现DI≥2.5的细胞；出现非整倍体细胞峰。

　　过去10年，国内进行了大量DNA倍体分析方法应用于宫颈癌筛查的研究，至今每年完成的实验达到100万项。大部分研究表明，与液基细胞学相比，DNA倍体分析方法显著提高了宫颈癌筛查的灵敏度，但特异度稍差[19]。张敦兰等[20]对875例ASC-US患者应用DNA倍体分析方法，以DNA异倍体细胞≥3个用于筛查CIN2及以上级别病变，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.3%、46.1%、40.8%和92.1%，表明DNA倍体分析可用于辅助ASC-US患者分流。阳艳等[21]探讨了细胞DNA倍体分析和高危型HPV DNA检测在ASC-US患者分流中的作用，二者预测CIN2及以上级别病变的阴性预测值分别为98.93%和94.74%；比较阴道镜活检结果每100个细胞中异倍体细胞百分比，百分比<0.1%和≥0.1%的病例之间，差异有统计学意义。以DNA异倍体细胞≥3个预测CIN2及以上病变，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为80.64%、47.06%、40.99%和84.21%。大量研究结果均提示DNA倍体分析和高危型HPV DNA检测同样可用于ASC-US患者分流，而且DNA倍体分析的费用比HPV DNA检测低廉，更适合我国国情，是一种值得推广的ASC-US患者分流方法。
　　四、免疫细胞化学标志物检测
　　随着宫颈癌发病机制研究的深入，越来越多的与宫颈不典型增生相关的致癌基因被发现，促进了更多宫颈癌筛查标志物在临床应用。高级别宫颈病变中，HPV病毒持续性感染，癌基因E6及E7的表达，破坏了表皮干细胞的正常细胞周期。从分子机制的角度分析，此时发生病变的宫颈细胞中细胞周期依赖性激酶抑制剂（p16）过表达，提示E7的活性表达。尽管p16的过表达与原癌基因E7的活性表达有很强的相关性，但是在进行单独p16的免疫细胞化学染色结果判读时，还需要参考形态学的特征，因为在一些非肿瘤性病变的细胞中偶尔也会有p16的过表达，如鳞状化生细胞。为了降低p16免疫细胞化学染色判读的主观性，又引入了另一个重要的细胞增殖指标Ki-67作为第二指标。Ki-67高表达是细胞增殖活跃的重要标志。正常宫颈鳞状上皮内Ki-67阳性细胞数目较少，CIN级别愈高，Ki-67阳性细胞核越多，因此测定Ki-67蛋白可用于判断宫颈病变的进展程度[22,23]。在正常的细胞周期中，作为抑制增殖的p16与作为增殖指数的Ki-67应该是相互排斥的，无法在同一个细胞周期表达。如果在单个的细胞中检测到这2个蛋白同时表达，则提示细胞周期失调。

　　国内外已有的研究表明，p16联合Ki-67检测对宫颈CIN2＋具有较好的特异度和灵敏度[24]。一项名为“PALMS”的多国家、多中心前瞻性研究，对2.7万名平均年龄在39.9岁的妇女进行宫颈癌筛查，筛查方法包括传统细胞学检测（巴氏涂片）、p16/Ki-67双染检测和HC2高危型HPV检测，以活检确认CIN2＋为检测终点。结果显示，在不影响特异度的情况下，双染检测比传统细胞学检测对CIN2＋的灵敏度提高18%（86.7%比68.5%），对CIN3的灵敏度提高了17%（88%比71%）。在526例低级别病变患者中，63例经活检证实为CIN2以上，而双染检测对这部分患者的特异度达到54%，远高于HC2高危型HPV检测。Schmidt等[25]对361例ASC-US患者的液基标本进行了p16/Ki-67双染检测和HC2高危型HPV检测，2种检测方法发现CIN2＋的灵敏度分别为92.2%和90.9%，特异度分别为80.6%和36.3%。Edgerton等[26]分析了63例ASC-US患者的细胞学标本，结果表明p16/Ki-67双染检出CIN2＋的灵敏度低于HC2高危型HPV检测（64%比100%），但是特异度明显提高（53%比21%）。Kisser和Zechmeister-Koss[27]总结了5篇p16/Ki-67双染检测分流ASC-US/LSIL患者作用的报道，发现p16/Ki-67双染检测和HPV检测分流CIN2＋的灵敏度分别为64%～92%和91%～97%，特异度分别为53%～81%和26%～44%。以上结果均表明p16/Ki-67双染检测与HPV检测相比，能够保持较高的灵敏度，并具有更高的特异度。此外，p16/Ki-67双染检测技术可减轻阅片医师的工作强度，不仅可用于对ASC-US、LSIL患者（特别是年轻女性）分流，在细胞学与HPV联合筛查时还可对细胞学阴性但高危型HPV阳性患者进行筛查，具有广阔的临床应用前景。

　　综上所述，高危型HPV检测是最经典的ASC-US分流方法，但HPV DNA检测不能将暂时性感染和转化性感染区分，暂时性感染占大部分，转化性感染则很少，在准确找出有临床意义的疾病方面，HPV DNA检测的作用有限，HPV E6/E7 mRNA检测的特异度相比HPV DNA检测有所提高，但仍相对较低，美国FDA认证批准的高危型HPV检测方法均适用于ASC-US患者分流，但可造成过多的阴道镜检查。细胞核DNA的含量易受化学、物理等因素的影响，如放射线、维生素B12缺乏等，所以DNA倍体分析目前难以准确诊断宫颈癌，但其价格低廉、便于推广，在经济欠发达地区可大量应用。近年来，对ASC-US患者的分流方法已有大量研究，为进一步诊断和治疗提供了新思路、新方法，尤其p16/Ki-67双染检测方法值得关注，但其中哪种方法对ASC-US患者进行分流和管理的同时，能够给予个体化处理，有效提高筛查效率，避免漏诊和过度诊治，并明显降低宫颈癌的发生率，仍需大样本的临床研究结果证实。

xiaofeng

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