胃癌HER2检测指南

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：《胃癌HER2检测指南》编写组

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胃癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤，中国为高发区，其预后较差。据报道约20%的进展期胃癌有HER2过表达或扩增[1，2，3]。一项国际多中心随机对照Ⅲ期临床研究（ToGA试验）的结果显示，化疗联合针对HER2的曲妥珠单抗治疗可显著延长进展期胃癌患者的生存期[4，5]，基于这一结果，2010年欧洲药品管理局及美国食品和药品管理局（FDA）先后批准化疗联合使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性胃及胃和食管交界处癌（以下统称胃癌）患者。

　　准确的胃癌HER2表达和基因扩增检测结果是进展期胃癌HER2靶向治疗患者筛选和疗效预测的前提[5]。多项有关胃癌HER2检测的研究发现胃癌和乳腺癌HER2表达的不同，认为有必要建立符合胃癌特性的HER2检测流程和判读标准[6，7，8]。例如，胃癌形成U型（基底和侧面）不完整膜染色应视为阳性；胃癌中肿瘤异质性比乳腺癌更常见[9]；因此胃镜活检标本中HER2阳性的判读标准取消了细胞染色百分比的临界值，但是10%的临界值仍然适用于手术标本。为推动和推广我国胃癌HER2检测工作，在欧洲药品管理局和美国国立综合癌症网络（NCCN）指南提出的胃癌HER2检测的技术路线、结果判读标准和质量控制等方面的基础上，经国内有关专家讨论并结合国内胃癌HER2检测多中心临床研究，参照《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》[10]，现提出《胃癌HER2检测指南》（以下简称指南）。本指南将对胃癌HER2状态检测的流程和判断进行详细说明，以供有条件开展胃癌HER2状态检测的实验室参考，从而达到检测操作程序和结果判读的标准化，准确的检测结果可帮助临床医师发现从曲妥珠单抗治疗中的获益患者。

　　一、HER2检测方法

　　包括免疫组织化学染色（IHC）和原位杂交（in situ hybridization）技术，后者包括荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和双色银染原位杂交（dual chromogen visualization with silver in situ hybridization，DSISH）。FISH和DSISH两种检测方法符合率高，各有特点，其中DSISH是一种亮视野下检测HER2基因扩增的方法，易于观察[11]，被认为更具有实际应用价值[12，13]。本指南推荐IHC与FISH或DSISH相结合的检测策略。

　　二、HER2检测适宜范围

　　有可能进行曲妥珠单抗治疗的进展期胃癌有必要行准确的HER2检测。

　　三、检测流程和结果判断

　　1.HER2状态检测首先选用IHC法。

　　2.IHC3＋的病例判断为HER2阳性，无需进一步做原位杂交检测。

　　3.IHC1＋和IHC0的病例，判断为HER2阴性，无需进一步做原位杂交检测。

　　4.IHC2＋的病例为不确定病例，需进一步行原位杂交检测，如原位杂交阳性，判断为HER2阳性；如原位杂交阴性，判断为HER2阴性。

　　四、组织标本的前期处理

　　1.标本类型：

　　手术切除标本和活检标本。原发病灶的手术切除标本最宜进行胃癌HER2检测；建议原发病灶的胃镜活检标本取6～8块，以获得足够的癌组织，多点活检能提高检测的准确性。所有标本均应有明确的病理诊断。

　　2.标本固定：

　　规范的标本固定是HER2检测质量的保障，能使组织形态保存良好，防止细胞内蛋白和核酸的降解。（1）所有标本应在离体后20～30min内进行标记、切开、固定等初步处理。（2）采用新鲜配制的4%中性缓冲甲醛液作为固定液；固定液的量应为组织的10倍；标本的固定时间为8～48h（活检标本也应保证至少1h/mm组织）。不宜使用其他固定液，因为非4%中性缓冲甲醛固定液可能会妨碍IHC和原位杂交检测的可靠性；不宜用微波快速固定组织。

　　3.组织脱水和包埋：

　　（1）采用常规组织脱水和包埋。应注意充分和良好脱水；（2）石蜡熔点应≤60℃、避免标本长时间置于融化的石蜡中；（3）使用新鲜的石蜡，并定期更换；（4）石蜡包埋标本可转运至有条件的实验室进行HER2检测。

　　4.蜡块选择和切片：

　　（1）手术切除标本应选择具有肠型组织学结构的肿瘤组织蜡块，无肠型组织学结构的病例挑选代表性的肿瘤组织蜡块，并有HE染色证实；（2）切片厚度会影响检测结果，建议IHC切片厚度3～5μm，原位杂交切片厚度4～5μm；将切片裱置于洁净的涂胶载玻片上，放置于室温下过夜或60℃1h干燥；（3）理想的切片应该在进行HER2检测前的短时间内进行，未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。

　　5.脱蜡：

　　用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化。脱蜡不彻底会影响检测结果。

　　五、HER2检测

　　（一）IHC检测方法

　　应当在有条件的实验室进行，拥有实验所需的仪器和设备及空间条件；实验室掌握包括标本的制备、抗体的选择、抗原修复方法及其他相关技术；实验室经过严格的内部和外部质量控制程序验证，建立完善的标准操作程序（SOP）；实验室技术人员具备相关资质及经过合格培训。

　　1.IHC方法：

　　检测方法根据实验室条件可以选择手工染色、半自动染色和全自动免疫组织化学染色；使用全自动染色方法，更易取得实验批次间结果的一致性。

　　2.抗体：

　　建议使用中国FDA批准的试剂盒；自行组配和分装的抗体必须经过严格的内部和外部质量控制程序验证，并与相关机构批准的检测试剂盒进行比对，以保证检测结果的可靠性。

　　3.染色过程：

　　（1）手工染色方法：严格按照试剂盒的标准程序执行。使用EnVision法和高质量的DAB显色液以避免内源性生物素的影响。建议采用煮沸热修复方法进行抗原修复。具体操作如下：将一定量0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）置不锈钢煮锅内，用电磁炉加热煮沸后调至95℃；放入脱蜡水化后的组织切片加热15min；停止加热后调至保温档保温10min；自然冷却至室温，取出玻片用TBS冲洗2遍，每遍2min，去除TBS液；染色过程中的每一步都要充分洗涤，始终保持切片潮湿；在显微镜下监控DAB显色过程，避免过度染色而造成很强的背景。（2）全自动染色：实验室应先进行严格的比对试验和程序优化；严格按照所用全自动染色仪器的优化程序和SOP执行。

　　4.对照：

　　无论采用何种IHC方法和抗体进行染色，每次检测均需设立阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照可采用已被证实HER2 IHC3＋的胃癌组织；被检测切片中癌旁形态正常的胃黏膜上皮组织是很好的阴性内对照；以PBS缓冲液代替一抗，作为空白对照。

　　5.结果判读和评分：

　　胃癌的IHC评分标准见表1，参见图1，图2，图3，图4。（1）胃癌及乳腺癌的组织学特性有差异，两者HER2的表达特点不同，因此两者IHC检测结果判读和评分标准有所区别。（2）与乳腺癌相比，胃癌HER2表达显示更强的异质性，癌细胞的不完全性膜着色比较常见。（3）由于IHC染色的异质性强，在判读和评分时必须观察整张切片，建议先在低倍镜下观察。（4）根据ToGA研究经验[5]，可以结合观察到清晰的肿瘤细胞膜完全性或基底侧膜、侧膜染色时使用的物镜倍数及染色强度，帮助观察者进行IHC评分，具体方法见表2。（5）IHC判读和评分时的注意事项：肿瘤组织细胞质、细胞核着色均为非特异性染色；结果判读应避开边缘及组织处理或形态不佳（如挤压明显）的癌组织。非肿瘤组织（肠化生及再生的胃上皮细胞膜）可能出现非特异性染色。





图1 HER2染色结果判读，自动染色仪IHC3＋，肿瘤细胞基底侧膜、侧膜强染色 ×400；

　　图2 HER2染色结果判读，自动染色仪IHC2＋，肿瘤细胞团有弱到中度的基底侧膜、侧膜染色 ×400；

　　图3 HER2染色结果判读，自动染色仪IHC1＋，肿瘤细胞团微弱或隐约可见膜染色 ×400；

　　图4 HER2染色结果判读，自动染色仪IHC0，肿瘤细胞无膜染色 ×400；

　　图5 FISH染色结果判读，HER2和CEP17信号各1～2个，比值1.65，提示HER2基因无扩增 ×1000；

　　图6 FISH染色结果判读，HER2红色信号增多，局部呈簇状，CEP17信号1～2个，比值7.2，提示HER2基因有扩增 ×1000；

　　图7 DSISH染色结果判读，HER2黑色信号扩增；CEP17红色信号1～2个；比值10，提示HER2基因有扩增 ×1000；

　　图8 DSISH染色结果判读，HER2和CEP17信号各1～2个，比值<0.8，提示HER2基因无扩增 ×1000；

　　图9 DSISH染色结果判读，HER2和CEP17信号都超过2个，17号染色体为多体，比值<0.86，提示HER2基因无扩增 ×1000。

　　6.HER2 IHC检测报告包含的内容信息见表3。



（二）原位杂交检测方法

　　应当在有条件的实验室进行，拥有FISH或DSISH检测所需的仪器和设备及空间条件；实验室掌握包括标本的制备、预处理、消化、杂交、洗涤等整个流程中的相关技术；实验室经过严格的内部和外部质量控制程序验证，建立完善的SOP；实验室技术员具备相关资质及经过合格培训。

　　1.原位杂交方法：检测方法根据实验室条件可以采用FISH或DSISH方法。探针建议使用中国FDA批准的试剂盒。FISH和DSISH的基本原理和判断标准相同，均使用HER2基因和17号染色体着丝粒（CEP17）的混合探针，杂交后分别计数肿瘤细胞内HER2和CEP17的信号数，以两者的比值判断结果，两者结果有很好的一致性。FISH的特点是敏感，双色荧光信号强度强，易于观察计数，但在荧光显微镜下不易观察组织学结构，有时甚至难于辨认肿瘤细胞，荧光信号易淬灭，切片不易长期保存；DSISH的特点是在光镜亮视野下观察，可结合组织学结构，易于确认肿瘤成分，切片可长期保存，但信号强度特别是碱性磷酸酶显色的17号染色体红色信号强度有时较弱而不易评判，当17号染色体多体性时因有信号重叠也可致与FISH结果不一致。

　　2.原位杂交对照的设定：已知阳性和阴性胃癌病例为外对照；同一切片中正常黏膜上皮、淋巴细胞或间质细胞为内对照。

　　3.原位杂交结果判断：胃癌HER2原位杂交判读方法参照ToGA研究经验[5]，FISH结果如图5，图6，DSISH结果如图7，图8，图9。（1）结果判读和评分：观察时避免计数重叠的细胞核、分裂期的细胞核或被截断的细胞核；不要计数不显示任何信号的细胞核和仅显示一种颜色信号的细胞核。建议先在20×物镜下观察整张切片找到肿瘤区域，然后在40×物镜下评价是否存在HER2扩增的异质性以及切片的质量，对FISH检测，进一步在100×物镜下观察肿瘤细胞核内的FISH信号，对DSISH检测，可直接在40×或60×物镜下观察。选择扩增程度最高的区域，至少20个连续肿瘤细胞核进行双色信号的计数和比值计算，HER2信号总数与CEP17信号总数的比值≥2.2，判断为原位杂交阳性，即有扩增；众多信号连接成簇或HER2与CEP17信号比值>20时可不计算比值，判断为原位杂交阳性；HER2信号总数与CEP17信号总数的比值<1.8，判断为原位杂交阴性，即无扩增。为保证检测结果的准确性，建议HER2与CEP17信号比值在1.8～2.2之间时，再计数20个细胞的信号或由另一位医师计数，若比值≥2.0判断为原位杂交阳性；比值<2.0判断为原位杂交阴性。在报告中应注明HER2和CEP17信号数的平均值；每个肿瘤细胞中CEP17信号数平均值≥3，定义为17号染色体多体，也应当在报告中说明。（2）若出现下列现象应视为检测失败，需要重新检测：外对照未出现预期结果；可计数信号的细胞<75%；>10%荧光信号出现于细胞质；细胞核结构难以分辨；FISH结果有很强的自发荧光；组织消化过度，细胞核被损坏，边界不完整，FISH表现为DAPI染色浅；组织消化不足，无信号；细胞核被切割得不完整，DSISH结果中细胞核内有大量空泡；直径明显小于其他细胞或细胞核重叠；缺乏HER2或CEP17信号。

　　4.HER2原位杂交检测报告内容信息见表4。



六、胃癌HER2检测的质控

　　胃癌HER2检测应在内、外部质量控制良好和有能力的病理实验室进行。

　　1.HER2蛋白表达和基因扩增的检测必须在标本的采集、处理过程、IHC/原位杂交检测方法和评判标准诸方面严格按照指南要求执行，以保证结果可靠。

　　2.不具备HER2检测条件的单位应按照指南要求，妥善处理和准备标本，提供给有质量保证的病理实验室进行检测。

　　3.实验室内、外部质量控制和实验室标准操作流程的主要要求：（1）拟开展检测的实验室应选择1～2家已较好开展该项检测的实验室进行25～100例标本的比对验证。（2）实验室应积极参加有关外部质量控制活动，外部质控阳性和阴性结果的一致性应达到90%以上，每年应进行1～2次。（3）从事检测的实验室技术人员和病理医师应通过必要的培训和资格考核。（4）实验室应建立完善的SOP文件，并做好每次检测情况的记录和存档工作。（5）任何改变操作程序和试剂的行为均应重新进行严格的验证。（6）内部质控应包括同一组织不同批次染色结果的重复性分析。每次染色应设置阳性和阴性对照。（7）检测相关的仪器和设备需定期维护、校验。

　　《胃癌HER2检测指南》编写组成员
　　《胃癌HER2检测指南》编写组成员（姓名按汉语拼音字母顺序排列）：步宏（四川大学华西医院病理科）、陈杰（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科）、杜祥（复旦大学附属肿瘤医院病理科 复旦大学上海医学院肿瘤学系）、黄丹（复旦大学附属肿瘤医院病理科 复旦大学上海医学院肿瘤学系）、刘键平（四川大学华西医院病理科）、刘艳辉（广东省人民医院病理科）、吕宁（中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院 肿瘤研究所病理科）、盛伟琪（复旦大学附属肿瘤医院病理科 复旦大学上海医学院肿瘤学系）、武鸿美（广东省人民医院病理科）、应建明（中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院 肿瘤研究所病理科）、郑杰（北京大学医学部病理学系）、周晓燕（复旦大学附属肿瘤医院病理科 复旦大学上海医学院肿瘤学系）

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