肺腺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药前后EGFR基因状态变化情况探讨

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：叶胜兵，李锐，时姗姗（南京军区南京总医院病理科）

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非小细胞肺癌占肺癌总病例数的75%～85%，是中国乃至世界上病死率最高的恶性肿瘤之一[1]，患者的5年生存率不足20%[2]。目前最常见的靶向治疗药物是表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要有吉非替尼和厄洛替尼两种，也是目前最成熟和重要的靶向治疗手段[3]。它主要通过与三磷酸腺苷竞争EGFR－TKI催化区的结合位点，阻断EGFR－TKI信号转导，从而起到抗肿瘤的作用[4]。然而所有患者不可避免的出现获得性耐药，针对该类患者，还没有标准的后续治疗，目前已经明确EGFR－TKI获得性耐药的主要机制是T790M突变及c－MET癌基因扩增。2014年美国临床肿瘤协会(ASCO)已公布AZD9291等针对耐药突变的第三代EGFR－TKI的疗效，现已上市，针对T790M突变的肺癌患者，缓解率可达64%[5]。对于EGFR野生型的非小细胞肺癌，EGFR－TKI的治疗效果欠佳[6]，但仍有部分患者能从中获益。本研究旨在通过对肺腺癌患者EGFR－TKI获得性耐药前后EGFR基因状态变化情况进行分析，并探讨导致这些基因变化可能的原因，希望能够对临床获得性耐药患者的后续治疗提供帮助。
资料与方法
1．资料来源：
　　收集2014年1月至2016年5月南京军区南京总医院EGFR－TKI治疗前以及EGFR－TKI获得性耐药后均进行取材的肺腺癌患者20例，其中EGFR－TKI治疗前突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)法EGFR基因检测有5例为阴性，15例为EGFR－TKI敏感性突变位点L858R和19－del，疾病进展时间4～18个月，男性13例，女性7例，包括EGFR－TKI治疗前：手术标本3例，穿刺标本7例，胸水细胞块10例；EGFR－TKI获得性耐药后：手术标本2例，穿刺标本7例，胸水细胞块11例。分别提取DNA，并用ARMS法进行EGFR基因第18、19、20、21号外显子突变检测，微滴式数字PCR系统(droplet digital PCR system，ddPCR)对其进一步验证。

　　2．仪器及试剂：
　　采用德国Qiagen DNA提取试剂盒进行DNA提取，ARMS法扩增采用ABI7500荧光定量PCR仪，EGFR检测试剂盒由厦门艾德生物医药有限公司提供。数字PCR扩增采用美国Bio－Rad公司QX－200微滴式数字PCR仪，微滴化试剂均购自Bio－Rad公司，数字PCR EGFR检测试剂盒由上海源奇生物医药科技公司提供。

　　3．方法：
　　严格按照ARMS法试剂盒说明书进行操作，用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共15个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共31个循环；后31个循环60 ℃收集FAM和VIC信号，进行数据分析。采用ddPCR对其结果做进一步验证，扩增条件：95 ℃，10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃，10 min；4 ℃保温，QX－200微滴分析仪进行检测，Quanta Soft分析软件进行数据采集与分析。
结果
20例肺腺癌患者中，5例EGFR－TKI治疗前EGFR基因野生型患者，在发生EGFR－TKI获得性耐药后EGFR基因同样为野生型。15例治疗前EGFR－TKI敏感性突变患者中，获得性耐药后有10例EGFR基因发生了改变，其中T790M突变的有8例，阳性突变比例为8/15；1例患者EGFR基因由原来的L858R变为G719X＋S768I双突变；还有1例患者EGFR基因由原来的19－del变为野生型(表1)。其次，EGFR－TKI获得性耐药后用ARMS法有2例发生T790M突变的胸水细胞块未检出，其余结果均与ddPCR保持一致(图1,图2,图3)。


表1EGFR－TKI获得性耐药前后EGFR基因突变情况


图1突变扩增阻滞系统法检测EGFR基因存在19－del和T790M双突变
图2微滴式数字PCR系统(ddPCR)检测EGFR基因存在19－del
图3ddPCR检测EGFR基因存在T790M突变
讨论
EGFR突变型在非小细胞肺癌发生EGFR－TKI耐药的机制很多，大致可以被分为4类：(1)EGFR基因二次突变；(2)旁路信号通路激活；(3)表型转化；(4)和EGFR突变同时发生的其他突变。另有30%耐药原因不明。

　　本组的研究结果显示T790M突变占EGFR－TKI获得性耐药的比例为8/15，与报道的结果基本一致[7]，然而有研究结果显示T790M突变发生率可能更高，一项重新活检试验结果为68%[8]。但EGFR－TKI耐药的患者中，相对于其他原因引起的耐药，T790M突变患者有更好的预后，病程发展较慢，进展后生存期更长，且未受累器官更不易发生转移[9]。EGFR－TKI获得性耐药第二位点T790M突变位于EGFR激酶区域，并与EGFR突变共存，我们检测到的8例T790M突变均与19－del或L858R共存，获得性T790M突变是EGFR突变型肺癌的亚群，其惰性增长，在临床前试验和临床实践中都得到证实[10]。

　　本组检测患者中有1例肺腺癌患者在EGFR－TKI治疗前EGFR基因发生了19－del，而在EGFR－TKI治疗后却变为了野生型，这种EGFR突变基因的丢失可能会导致肺癌细胞产生获得性EGFR－TKI耐药。有学者报道这种对EGFR突变基因"成瘾"的丢失可以促进HER2/HER3、PI3K/AKT信号通路激活而导致获得性EGFR－TKI耐药[11]。还有1例肺腺癌患者在EGFR－TKI治疗前EGFR基因发生了L858R突变，而在EGFR－TKI治疗后却变为G719X＋S768I双突变。既往研究提示相对于G719X及L861Q而言，吉非替尼或厄洛替尼对于S768I细胞系的IC50值更高，提示S768I突变可能对吉非替尼耐药[12]。但有学者研究中发现阿法替尼对S768I及L861Q等突变亚型有效，其无病进展生存时间在8～14个月之间。S768I在少见突变位点中最为常见，并常伴有G719X或T790M双突变。

　　Lee等[6]研究表明，在EGFR野生型患者中，与EGFR－TKI相比，化疗组无进展生存时间和客观缓解率更具优势，但总生存期无明显差异。因此对于EGFR野生型患者，化疗可能是一个比EGFR－TKI更好的治疗选择，但仍有部分患者从EGFR－TKI中获益。本试验中的5例EGFR野生型患者均从EGFR－TKI获益，结果显示获得性耐药前后EGFR基因都没有发生改变，均为野生型，这可能与其他基因突变或扩增以及其他信号通路激活等因素相关。

　　由于很多患者病情进展中不接受再活检，缺乏可用的耐药肿瘤组织限制了对患者进行分层研究获得性耐药，这时以血液为主的液态活检技术显得尤为重要，但血液中肿瘤DNA含量相对较少，我们期待能有高灵敏度和精准度的EGFR基因血液检测方法以及标准的操作流程应用于临床检测，为更多的EGFR－TKI获得性耐药患者提供帮助。

　　对于EGFR突变型非小细胞肺癌而言，确定EGFR－TKI敏感或者耐药的分子机制是优化TKI治疗的主要障碍。对EGFR－TKI治疗的临床标本进行全程管理和分析可以更好地认识、了解耐药机制。因为我们需要确定是否根据肿瘤组织的驱动基因的改变而针对单个或多个驱动基因进行靶向治疗[13,14]。

　　在非小细胞肺癌患者中，EGFR野生型占很大的比率，因此需要寻找新靶点及研发新的靶向药物，寻找新的分子预测标志物、探索靶向联合阻断相关通路等途径。期待更多的研究和临床试验为EGFR野生型患者找到最佳的治疗方案。

绿绣芙蓉

看到这篇文章，想建议下各单位在送分子检测，尤其是二代测序时，样本量要足，最好取肿瘤组织保存比较好的蜡块来做。组织过小的时候可能提取的量达不到检测线的要求。