HER2免疫组织化学结果不确定的乳腺癌原位mRNA表达特征

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：武莎斐，刘媛媛，姜英，罗玉凤，崔全才，梁智勇，曾瑄（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科）

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摘要  
目的：了解HER2免疫组织化学结果不确定的乳腺癌荧光原位杂交（FISH）阳性和阴性两组患者的原位mRNA表达特征，探索mRNA原位杂交（RNAscope）用于乳腺癌组织HER2检测的潜在可行性。

方法：收集北京协和医院2010年6月至2013年6月间手术获得的69例乳腺浸润性导管癌组织HER2免疫组织化学结果不确定（IHC 2＋）的石蜡标本，并制作组织芯片，分别采用FISH和RNAscope技术检测其HER2基因状态和原位mRNA表达，计数100个癌细胞，按mRNA表达量从低到高的5个等级（0、1、2、3、4分）判读mRNA结果。分析FISH阳性和阴性两组患者HER2 mRNA的表达特征。

结果：在69例标本中，FISH阳性共23例，其中RNAscope 16例（70%，16/23）4分、6例（26%，6/23）3分、1例（4%，1/23）2分。96%的HER2 FISH阳性标本为原位mRNA高表达（RNAscope≥3分），RNAscope 4分的标本全部为FISH阳性。在FISH阴性的46例标本中，RNAscope 17例（37%，17/46）3分、25例（54%，25/46）2分、4例（9%，4/46）1分。

结论：根据原位mRNA表达结果，可将IHC 2＋乳腺癌病例进一步分类，其中以RNAscope 4分为mRNA高表达的判读标准可能成为确认IHC 2＋结果的检测技术。HER2原位mRNA检测可作为提示乳腺癌HER2基因扩增和蛋白质表达的候选检测手段，具有潜在的临床应用价值。

　　准确判断乳腺癌组织的HER2状态，对于评价患者预后以及判断相关药物（特别是分子靶向药物）疗效具有非常重要的意义。目前公认的乳腺癌HER2检测方法包括免疫组织化学（IHC）和原位杂交法（ISH），分别针对其蛋白表达和基因扩增进行检测。根据HER2检测指南，如果IHC结果为不确定（IHC 2＋），则应再行ISH检测，若ISH结果显示为阳性，则视为HER2阳性，反之亦然[1]。约4%的标本IHC与ISH结果不一致[2]。在临床实践中，蛋白过表达或基因扩增结果均为HER2阳性的判定依据，一直以来学者对导致2种检测结果不一致的分子基础开展了很多研究。我们拟采用一种新的原位mRNA表达分析技术（简称RNAscope）[3]揭示HER2 IHC 2＋乳腺癌组织荧光原位杂交（FISH）阳性和阴性的2组标本的mRNA表达状态，探索RNAscope技术用于检测IHC 2＋病例HER2状态的可行性，以及该方法是否可作为HER2不确定（由IHC和ISH检测）病例的基因扩增候选检测方法，以辅助排除标本处理或抗体相关试剂等问题所致的IHC结果偏差或ISH技术缺陷，并进一步了解除HER2基因扩增之外，可能存在的其他因素导致的HER2蛋白异常表达[4]，为改进及补充HER2表达的检测方法提供参考。

材料与方法
1.材料：

　　选取北京协和医院病理科2010年6月至2013年6月期间手术切除并诊断为IHC 2＋的乳腺浸润性导管癌存档蜡块69例，制备成直径为1mm的组织芯片，每个病例取2个点。患者为29～82岁的女性，中位年龄56岁。其中低分化24例，中分化40例，高分化5例；有淋巴结转移者47例。组织芯片蜡块切4μm厚切片5张，贴于防脱切片上，分别用于HE染色（1张）、FISH检测（1张）以及RNAscope检测（3张）。

　　2.FISH：

　　采用PathVysion探针试剂盒（美国雅培公司）进行HER2基因状态检测。大体流程：常规烤片及脱蜡后，将待检测的组织芯片切片放于ThermoBrite Elite自动FISH染色机（德国徕卡公司）内，依次进行预处理、杂交及洗脱。切片经DAPI复染，盖上盖玻片。在Ariol全自动显微图像扫描分析系统（德国徕卡公司）下观察并分析结果。FISH判读标准依照乳腺癌HER2检测指南（2014版）[1]，计数至少2个以上浸润区内≥20个独立、DAPI染色均匀、同时具有红绿信号的癌细胞中HER2基因（橘红色）和第17号着丝粒（CEP17，绿色）的信号数目，若HER2/CEP17≥2或HER2平均拷贝数≥6，则FISH结果为阳性。

　　3.mRNA原位杂交（RNAscope）：

　　采用RNAscope FFPE 2.0试剂盒（美国ACD公司）检测HER2 mRNA的表达。流程：切片常规脱蜡后进行加热及蛋白酶消化处理，加探针（针对HER2 mRNA靶序列的20对探针组合）后，置于杂交炉（美国ACD公司）内进行杂交，杂交后的切片依次进行洗脱和信号扩增，以DAB显色及苏木精对比染色。另2张切片同时分别以看家基因PPIB和细菌基因DapB做阳性和阴性对照。用Aperio CSⅡ数字病理扫描系统（德国徕卡公司）进行图像采集及存档。对比HE染色的切片，于20倍物镜下观察全切片上癌细胞的HER2 mRNA杂交显色情况。于40倍物镜下计数100个癌细胞中的杂交信号，按如下5个等级判读结果：平均每个细胞中<1个信号为0分，1～3个信号为1分，4～9个信号及无/少量呈簇状信号为2分，10～15个信号为3分（若<10%瘤细胞中的信号呈簇状也归为此类），>15个信号为4分（若>10%瘤细胞中的信号呈簇状也归为此类），最高表达为4分，无表达为0分。
结果
69例HER2 IHC 2＋乳腺癌患者的组织芯片标本都可见清晰的棕黄色mRNA表达信号点，细胞核对比染色为浅蓝色。组织结构较清晰，易于镜下观察。在癌细胞和非癌细胞的细胞核内，均可见数量不等的信号，信号位于细胞质及细胞核的位置。在mRNA高表达的癌细胞中信号数较多（3或4分），在mRNA低表达的癌细胞中信号数较少（1或2分），本组未见0分的标本。由于细胞膜未染色，所以每个细胞内平均信号数即由癌细胞团内全部信号数除以细胞核的数量所得。

　　本组IHC 2＋标本的HER2 mRNA均有不同程度的表达，其中RNAscope 4分16例，全部为FISH阳性（图1）、3分23例、2分26例、1分4例。69例标本中，FISH阳性共23例，其中RNAscope 4分的16例（70%），3分的6例（26%，图2），2分的1例（4%，图3），即可见96%的HER2 FISH阳性标本为RNAscope高表达（≥3分）。其中，第2号标本HER2/CEP17＝1.83，但平均HER2拷贝数为6.5，视为阳性，RNAscope判定为3分，第23号标本，HER2/CEP17＝2.04，虽视为阳性但平均CEP17为1.35，RNAscope判定为3分。在FISH阴性的46例标本中，RNAscope 3分的17例（37%），2分的25例（54%），1分的4例（9%，图4）。



图1～4 免疫组织化学检测结果为HER2 2＋的病例HER2基因状态及原位mRNA检测结果；

　　图1 示RNAscope评分为4分（1A）的病例HER2基因扩增（1B）；

　　图2 示RNAscope评分为3分（2A）的病例HER2基因扩增（2B）；

　　图3 示RNAscope评分为2分（3A）的病例HER2基因扩增（3B）；

　　图4示RNAscope评分为2分（4A）的病例HER2基因未检出扩增（4B） A为RNAscope法 中倍放大，B为FISH法 ×1000。
讨论
肿瘤分子标志物的分析已成为肿瘤个体化医疗的重要内容，几乎涉及诊断、评价预后及预测药物疗效的各个层面。例如使用吉非替尼和克唑替尼治疗肺癌，需分别检测EGFR基因突变和ALK基因融合，若以威罗菲尼治疗黑色素瘤，需检测其BRAF基因突变。其中，基于病理切片的原位分析技术，因其固有的特点及优势，在临床实践中备受关注，应用极为广泛。例如检测各种蛋白表达的免疫组织化学技术和检测基因改变（融合、扩增和丢失等）的FISH技术，其中最具有代表性的就是IHC和FISH检测HER2表达和扩增，用于筛选对曲妥珠单抗敏感的乳腺癌患者。但就检测方法而言，绝大多数用于临床诊断的技术都基于蛋白质和DNA层面，少数mRNA分析技术由于提取过程破坏了组织形态、受制于mRNA结构稳定性等因素的影响[4]或原位mRNA检测方法的灵敏度和/或特异度不高、操作复杂等，难以达到临床要求，因而较少或不被采用。

　　一种新的原位mRNA分析技术RNAscope，因其特有的探针设计及信号放大体系，提高了检测的灵敏度和特异度，降低了非特异的杂交背景，操作简便，可用于常规石蜡标本的原位检测，尤其在实体肿瘤分子靶标的研究中凸显独特的优势[3]，应用领域越来越广。RNAscope技术可根据实验需求，采用亮视野（DAB或快红）或暗视野（荧光）检测系统，并可以显示单色（一种mRNA靶标）或多色（多种mRNA靶标）。染色后的切片保留了相对完整的组织结构和细胞形态，且固有癌旁和非癌组织细胞的可视内对照，易于定位和准确判读，实验操作稳定性和重复性好，切片便于镜下观察和长期保存。

　　按照乳腺癌HER2检测指南，IHC 2＋的乳腺癌组织需采用ISH方法再行检测，以确认蛋白检测结果表达的真实性。HER2阳性的病例可能因抗体结合力降低或标本处理不当致抗原部分丢失，导致染色强度偏低。HER2阴性的病例可能因过度修复等实验条件不当或非特异吸附等因素导致染色偏深。相比之下，采用ISH技术（最常使用的是FISH）检测HER2基因的变化时，探针结合的DNA靶序列稳定性比蛋白高得多，而且有核细胞（癌细胞和非癌细胞）的同源序列可同时显示信号，有可视的内对照使得结果更可靠。但是，不排除HER2蛋白过表达存在基因扩增以外的其他分子机制[5]，提示FISH检测也同样有局限性。所以，在临床实践中可能存在IHC与FISH结果不一致的情况，如FISH阳性而IHC非3＋。尤其是IHC 2＋的病例FISH结果可能为阳性或阴性，用其他方法（如数字微滴PCR）验证时，结果与IHC及FISH之间也存在不同程度的差异[6]。此外，部分IHC 2＋/FISH–的患者对曲妥珠单抗治疗有较好的反应性[7]。因此，探索及总结HER2基因及蛋白表达的生物学特征对进一步阐明HER2在乳腺癌发生发展中的作用，进而更好地实施乳腺癌的个体化治疗具有重要的现实意义。

　　本组69例IHC 2＋的乳腺癌标本中，16例为RNAscope 4分，全部为FISH阳性。在FISH阴性的标本中则未见RNAscope 4分的标本。我们由此推测，在某些情况下，例如遗传异质性较大的标本在低倍荧光暗视野下不易观察时，使用RNAscope复检IHC不确定的标本似乎是可行的。另外，IHC 2＋的标本FISH结果不同，mRNA表达的检测结果也存在明显差异，仅就本组病例的分析结果看，相比IHC而言，原位mRNA表达结果更准确地反映出HER2的实际表达状态，提示分层分析mRNA表达是有意义的。本组未见RNAscope 0分的标本，提示IHC 2＋的病例或多或少都有HER2 mRNA的表达，提示采用IHC检测HER2蛋白表达仍有进一步优化的必要。在46例FISH阴性的标本中，17例为RNAscope 3分，即病例中HER2 mRNA均有较高程度表达，与IHC 2＋蛋白表达的结果基本一致，提示以RNAscope方法检测HER2表达具有潜在可行性。另一个值得关注的现象是FISH阴性的标本中有4例RNAscope 1分的标本，即mRNA表达量非常低，但IHC检测结果为2＋，原因有待进一步探讨。除RNAscope 4分的病例均为FISH阳性以外，RNAscope 1～3分与FISH结果或乳腺癌患者的临床病理特征之间未见明显相关性，因标本量有限，需更大样本量的研究结果验证。本组1例HER2平均拷贝数>6和1例CEP17为单体的FISH阳性标本，均有mRNA较高程度的表达（RNAscope 3分），间接印证了FISH结果。

　　乳腺癌HER2蛋白过表达是HER2基因扩增所致，而且在肺癌、膀胱癌、前列腺癌和消化道肿瘤中，其发生机制类似，在临床实践中却有约4%的乳腺癌患者IHC和FISH结果不一致，例如IHC 3＋/FISH–、IHC 0/FISH＋、IHC 1＋/FISH＋[2]，不排除基因扩增以外的机制导致HER2蛋白过表达[5]，提示蛋白表达的检测方法仍待进一步优化[4]。本组IHC 2＋的乳腺癌病例中，1例mRNA低表达（RNAscope 2分）的标本为FISH阳性，提示采用其他方法检测并进行随访。

　　本组采用的原位mRNA检测方法具有很好的稳定性，2010年6月至2013年6月术后标本的检测都得到了满意的结果，但是，由于本组乳腺癌蜡块均经临床常规标准HER2 IHC检测（基于Ventana BanchMark XT自动IHC机和4B5抗体）且染色结果较好，不排除其他标本因信号弱或染色失败导致染色不佳而影响结果。另外，5个等级的人工结果判读标准的制定，基于RNAscope前期研究的经验值并加以修改，该标准是否科学、适宜及便于应用，需根据更多研究数据、IHC/FISH检测结果的比较分析及靶向药物治疗效果的反馈做出调整。原位mRNA分析技术为分子病理诊断补充了潜在技术平台，它不仅规避常规即时定量PCR技术检测mRNA的核酸提取等繁琐环节，而且保留了组织细胞原位的结构信息，同时不受抗体制备环节的诸多限制。该技术潜在的应用领域十分广泛，例如在无适宜抗体情况下直接检测肿瘤标志物的mRNA表达或应用于非编码RNA的研究。另外，DNA的变化种类繁多，在尚难以全面认识其变化之前，直接检测基因异常所致mRNA的表达，也不失为一种准确和简便的方式。

xiaofeng

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绿绣芙蓉

核酸提取不具有原位分析的功能，而且很多检测的质控标准把握不是很严。所以有代表性的结果原位杂交还是非常好的。