人乳头状瘤病毒相关头颈部鳞状细胞癌研究进展

阳光56

来源：中华病理学杂志
作者：崔力方（首都医科大学附属北京同仁医院病理科 头颈部分子病理诊断北京市重点实验室（现在首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科））刘红刚（首都医科大学附属北京同仁医院病理科 头颈部分子病理诊断北京市重点实验室）

本文经《中华病理学杂志》授权发布，其他媒体转载或引用须经《中华病理学杂志》同意，否则追究法律责任。

头颈部鳞癌是人体第六位常见的恶性肿瘤，每年全世界大约新增40万病例，约占所有恶性肿瘤的3.5%。大部分头颈部鳞癌起源于口腔、口咽、鼻咽、下咽和喉。头颈部鳞癌预后很差，5年生存率<50%，其主要危险因素包括吸烟和饮酒[1]。人乳头状瘤病毒（HPV）是双链DNA病毒，约含有8000个碱基对，已发现180余种HPV亚型，并根据HPV与宫颈癌的关系，将HPV分为高危型HPV（HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82）和低危型HPV（HPV26，30，34，53，66，67，69，70，73，82，85）。高危型HPV亦可导致其他部位的肿瘤，每年在全球范围内约有60万例HPV相关性肿瘤发生。近年来发现一组HPV相关的头颈部鳞癌，该组病例能够检测出高危型HPVDNA（约95%为HPV16），与HPV阴性的头颈部鳞癌相比，具有较好的预后，并且对放疗、化疗反应更加敏感[2]。据此推测有两个途径可导致头颈部鳞癌，一个与吸烟、饮酒相关，而另外一个则与HPV介导相关。本文就HPV与头颈部鳞癌的相关研究进展做一综述。

一、HPV的检测方法
目前可采取多种方法检测HPV，包括聚合酶链反应（PCR）、即时定量PCR检测病毒载量、DNA原位杂交、血清抗体检测及采用免疫组织化学方法检测p16替代HPV的检测等。尽管在冷冻组织中采用PCR方法检测HPVE6基因的表达是确定HPV存在的金标准，但是由于其敏感性、特异性、可重复性及花费等多方面因素的影响而限制了其推广应用。PCR方法是一个级联放大的过程，部分学者认为该方法过于敏感，容易出现假阳性，假阳性可能来源于周围的上皮内瘤变，潜伏性感染甚至是实验室污染。p16作为HPV感染的替代指标在口咽癌中具有较高的敏感性及特异性，但目前数据表明，p16在喉鳞癌、口腔癌及下咽癌中并不是一个较好的替代指标[3]。因为，尽管在大部分具有HPV转录活性的病例中p16强表达，但p16的特异性很差，即很多p16阳性的病例并未检测到HPV。检测血清中HPV特异性IgG可以用来反映患者HPV的感染状况，虽然一项早期的研究发现血清中HPV特异性抗体的存在与头颈部鳞癌的风险之间存在的密切联系[4]，但是由于血清特异性抗体不能反映出HPV感染的部位，故其特异性较低。DNA原位杂交方法可在不同的标本中（石蜡切片，冷冻切片或细胞）通过光镜直接观察HPV在样本中的分布，这使回顾性分析成为可能，并且能够区分是真正的病因相关性HPV感染（所有的肿瘤细胞均表达）还是污染（只在几个细胞中散在表达）；另外，原位杂交技术具有较高的敏感性及特异性。因此，有学者认为原位杂交技术是个临床最有用的证实HPV感染的方法。在肿瘤中检测到具有转录活性的HPV是HPV相关肿瘤形成的一个最直接证据，RNA为基础的原位杂交技术被认为是更有效的检测HPV相关肿瘤的方法，其中RNAscope方法是一种新型RNA原位杂交技术，使单个RNA的转录变得可视化，是目前最精准的RNA检测技术[5]。基因芯片技术不仅可用于分型，而且可以对多个型别的混合感染情况同时进行监测，虽然目前该技术成本昂贵，但基因芯片技术对HPV的分型检测具有广阔的发展前景。Cullen等[6]开发了一种高通量的新一代测序全基因组的方法检测HPV，该方法能够发现新的单核苷酸多态性，连续缺失暗示病毒整合，并且能够敏感检测不同谱系的混合感染，为更好地研究HPV变异在流行病学及肿瘤形成中的作用提供新的方法。
二、HPV在头颈部鳞癌中的表达及意义
1.HPV与口咽癌：
　　目前研究认为，HPV是口咽部鳞状细胞癌发生的一个重要危险因素[7]。口咽位于咽喉的中部，包括软腭、舌根、扁桃体和咽喉的后侧壁。口咽部鳞状细胞癌多好发于40～55岁男性，既往认为与吸烟及酗酒密切相关。近30年来，尽管男性吸烟量明显降低，口咽部鳞状细胞癌的发病率却有增加，认为一个原因可能是由于性行为（多个性伴侣、口交等）导致HPV感染所引起[8]。学者发现此HPV相关口咽部鳞状细胞癌一般为40～59岁的男性白人，不吸烟，并且具有较高的社会经济地位，较多的性伴侣。其病理学特点一般为起源于扁桃体隐窝，与表面上皮的异型增生无关，肿瘤呈小叶状生长，具有基底样鳞状细胞癌的特征，肿瘤内伴有大量淋巴细胞浸润，强表达p16，弱表达p53，一般增殖指数较高（>70%）。临床上通常为Ⅲ或Ⅳ期患者，淋巴结转移灶为囊性或多灶性[9]。美国国家癌症研究所资助的东方合作肿瘤协作组（ECOG）进行了一项2期临床试验，入选者为Ⅲ或Ⅳ期的口咽部鳞状细胞癌患者，均未手术，治疗包括两个周期的化疗（卡铂和紫杉醇），然后每周紫杉醇伴标准放疗（总剂量70Gy，超过7周）。所有的肿瘤均检测了HPV16（原位杂交方法）及p16（免疫组织化学方法）的表达状况，发现HPV阳性的患者中95%均强表达p16，且HPV阳性组的患者其治疗反应、无病生存率及总体生存率均高于HPV阴性组。Lajer和vonBuchwald[10]及O′Rorke等[11]的报道与该结果相一致。但HPV阳性的患者如果大量吸烟，其生存率则明显低于不吸烟的HPV阳性患者[12]。

　　2.HPV与口腔癌：
　　Isayeva等[13]总结了60篇文章中约4195例口腔鳞癌患者的相关资料，705例患者能够检测出HPVDNA（包括所有类型的HPV），其患病加权率为20.2%（95%可信区间16.0%～25.2%），无地域差异，其中53例为疣样癌，41.5%（22/53）包含HPVDNA，其患病加权率为47.2%（95%可信区间13.6%～83.6%）；虽然疣状癌比普通型鳞癌的患病加权率稍高，但是无统计学意义，可能是由于研究样本过小的缘故。Smith等[14]发现健康人群中也可检测到HPV感染，并且出现双峰，一个高峰出现在小于1岁的婴幼儿，峰值为2.5%，另一个峰值为3.3%，出现在16～20岁的青少年。健康人群中检测到HPV其患病加权率明显低于口腔癌患者，提示HPV在口腔癌的形成中可能发挥着一定的作用。Kaminagakura等[15]检测了114例口腔癌的患者，其中22例（19.2%）能够检测到HPV16，与性别、临床分期、组织学分级等均无关，并且其总体生存率在HPV阴性组及阳性组间无明显差异。Smith等[16]同时检测了口腔癌患者血清及肿瘤组织内的HPV，结果提示HPV与预后无关。

　　3.HPV与鼻窦癌、鼻咽癌：
　　WHO提出HPV可能为鼻窦鳞癌的一个致病因素，但HPV与该疾病的确切病因学关系并不明确。El-Mofty和Lu[17]检测了39例鼻窦、副鼻窦的鳞状细胞癌HPVDNA，发现4/21（19.0%）的非角化鳞状细胞癌能够检测到HPVDNA，并且其中1例为p16弥漫阳性，而在非角化鳞状细胞癌组，4/8的病例检测到HPVDNA并且5/8的病例弥漫表达p16。该研项究提示在角化型鳞状细胞癌中，HPVDNA的检测率要高于p16的表达，而p16是代表病毒癌基因产物的指标，这就提示在大部分角化型鳞状细胞癌中，HPVDNA的存在可能是一个偶然事件。另外，虽然该组病例数量较少，HPVDNA阳性/p16阳性的病例在非角化鳞状细胞癌中要多于角化型鳞状细胞癌，这与口咽部鳞状细胞癌中的报道是一致的。Thavaral[18]总结文献发现，非角化鳞状细胞癌中HPV检出率为34%～58%，而在角化型鳞状细胞癌中为0～5%，对于基底样型和乳头状鳞状细胞癌高达50%和80%。但由于该组疾病较少见，所研究的病例样本量较少，仍需要进一步的研究证实。在鼻咽癌中，大部分病例中HPV与EB病毒似乎是相互排斥的，但是也有极少数病例同时存在HPV及EB病毒的感染，因此美国病理学家建议在EBV阴性的鼻咽癌中检测HPV，而这需要除外口咽部鳞状细胞癌直接蔓延到鼻咽部的病例[18]。

　　4.HPV与喉鳞癌：
　　喉鳞癌是头颈部鳞癌中最常见的恶性肿瘤，全世界发生率约占所有恶性肿瘤的2.2%。文献报道喉鳞癌中也可检测到不同比率的HPVDNA。2005年一项包括1435例喉鳞癌的研究表明，喉鳞癌的HPV感染率为24%[19]，而Gallegos-Hernndez等[20]报道HPVDNA检出率分别为50%及13%。另外，HPV与喉鳞癌的临床特征及预后之间的关系也存在很大争议。Jacob等[21]发现喉癌中存在HPV，但是喉癌HPV与临床特征，如年龄、部位、分级、淋巴结转移和分期等无关；有学者研究显示声门型喉鳞癌中HPV阳性率为44.4%，比其他部位的喉鳞癌HPV阳性率要高，有学者提出声门上型HPV阳性率较高，并认为可能是由于其切缘紧邻口咽导致其HPV感染率增高[22]；Jiang和Lin[23]检测了71例喉鳞癌患者，其HPV阳性组无病生存率及总体生存率均高于HPV阴性组，提示HPV是预后较好的一个指标。但Morshed[24]检测了79例喉癌患者，发现HPV阳性组及阴性组无病生存期及总生存期均无明显差异。存在以上差异可能是由于地域不同、标本部位不同、检测方法不同及标本数量的不同等所造成，这需要大样本的研究来进一步明确HPV与L-SCC的关系。
三、HPV在头颈部鳞癌形成及发展中的作用机制
HPV可分为3个编码区：早期区（E1-E7区）、晚期区（L1-L2区）和上游调节区。每区都有各自的功能：E1区涉及病毒DNA复制；E2区主要调节病毒mRNA转录与复制；E4区与病毒组装有关；E5区可以影响细胞生长因子受体；E6和E7区与病毒的细胞转化功能及致癌性有关；晚期区的L1和L2分别编码病毒主要衣壳蛋白和病毒次要衣壳蛋白并参与病毒装配；E3区和上游调节区的功能尚未研究清楚。

　　大部分HPV会在感染的24个月内被清除或处于潜伏状态。而在肿瘤形成过程中，HPV首先整合入宿主DNA，通常在E2开放读码框处（ORF）断裂，破坏基因的连续性，部分E2、与E2-E4相邻的部分ORF、E5和部分L2被删除，然后病毒开始转录。HPVE6与宿主泛素连接酶E6相关蛋白（E6AP）结合使p53泛素化，导致p53降解，从而阻断了p53抑制肿瘤的作用。pRb能够通过与E2F结合调节细胞周期进展、分化、分裂和凋亡。E7破坏了Rb-E2F复合物，导致pRb的失活，E2F释放后激活反应基因如cyclinE、cyclinA等导致细胞G1～S期的转化，引起细胞增殖。E7蛋白同时可以诱导p16的表达增高，而这进一步使pRb失活，形成反馈性调节。在口咽部鳞状细胞癌细胞系中，通过shRNA沉默E6/E7蛋白后，p53、pRb表达，从而使依赖p53的CDKN1A（p21）和FAS表达升高，并且pRb下调了DEK和B-MYB的表达；此外，E6/E7被抑制后诱导细胞凋亡，降低了细胞的活性[25]。E6/E7能够使细胞出现分裂缺陷，如多级分裂及非整倍体分裂，并使细胞存活、不断积聚。此外，E6和E7能够抑制免疫系统的应答，从而引起HPV的持续感染。TLR9是病毒DNA传感器，能够激活抗原提呈细胞。E6/E7能够下调TLR9的表达，从而阻断特异性T细胞的激活，并且使Th1/Th2比例失调，Th2细胞因子升高，Th1细胞因子（γ干扰素、白细胞介素12、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α）等降低，导致免疫逃逸，最终引起肿瘤[26]。
四、HPV相关头颈部鳞癌的试验性治疗
头颈部鳞癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗或多种方法同时应用，但是其局部复发率及病死率仍然较高。为了提高患者的生存率，目前正在进行的临床试验性治疗包括癌症疫苗、靶向治疗和免疫治疗。针对HPV的疫苗已经有5种进入临床开发阶段，包括2个肽疫苗，脱毒E7DNA疫苗及2个载体疫苗。在一项肽疫苗的Ⅰ期试验中，5例进展期头颈部鳞癌患者中有4例产生了免疫力，但是未出现明显的临床效应。HPVpNGVL4a-CRT/E7（Detox）DNA疫苗目前也正处于Ⅰ期试验中，该疫苗包括了HPV16E7基因用来破坏pRb的结合部位，从而抑制肿瘤形成，经过该临床试验最终可能会决定其治疗模式[27]。

　　HPV相关口咽部鳞状细胞癌靶向治疗的靶点包括PIK3CA和表皮生长因子受体（EGFR）。PI3K途径是HPV相关口咽部鳞状细胞癌最常见的突变途径，针对PI3K的抑制剂正在研究中。EGFR的突变大概发生在10%HPV相关头颈部鳞癌中，亦可能成为潜在的治疗靶点[28]。

　　较有前途的一项免疫治疗是PD-1/PD-L1免疫疗法。PD-1是CD28/CTLA-4家族中的一员，是免疫反应的负向调节因子，表达于细胞毒T细胞、NK细胞、B细胞及巨噬细胞。PD-1有两个受体：PD-L1和PD-L2。PD-L1在抗原的慢性刺激下，其在树突细胞及巨噬细胞中表达上调，这与肿瘤微环境中的表达一样。许多肿瘤包括头颈部鳞癌中PD-L1表达上调，从而诱导树突细胞及巨噬细胞对肿瘤抗原的耐受性。临床数据表明阻断PD-1/PD-L1途径是可行的。一项关于BMS-936558（人IgG4抗PD-1单克隆抗体）的Ⅰ期实验中，包括了非小细胞肺癌、肾癌及恶性黑色素瘤的患者，其中31例患者有治疗反应，并且20例患者经过治疗后，其有效时间超过1年[29]。同样，针对BMS-936559（人IgG4抗PD-L1单克隆抗体）的Ⅰ期实验中，在进展期实性肿瘤患者中有6%～17%的患者具有较持久的疗效[30]。

　　总之，近30年的研究表明HPV在头颈部鳞癌形成发展中发挥着重要作用，HPV相关头颈部鳞癌是一组具有特殊临床病理特征的疾病，主要组织学类型为基底样型鳞癌，也可能小部分表现为乳头状鳞癌及疣样癌，其在治疗及预后方面与HPV阴性的头颈部鳞癌不同。因此，准确检测HPV相关头颈部鳞癌并针对该群体进行精准治疗将会提高患者的生存率。

xiaofeng

感谢分享！