非小细胞肺癌靶向药物治疗相关基因检测的规范建议

阳光56

作者及来源
王恩华 朱明华 步宏 陈杰 丁彦青 周晓军 梁智勇 张祥宏 孙保存
中华医学会病理学分会胸部疾病学组
国家卫生和计划生育委员会临床病理质控与评价中心分子病理学组
中国医师协会病理医师分会分子病理学组
中国抗癌协会肿瘤病理学分会分子病理学组
中华病理学杂志, 2016,45(02): 73-77.


一、检测非小细胞肺癌(NSCLC)常见靶向治疗相关基因的意义


肺癌是世界范围内发病率及病死率均居于首位的恶性肿瘤[1]，其中NSCLC约占85%左右。随着对其分子途径探索的逐步深入和相对应的靶向药物的不断出现，给其中的部分晚期患者带来了新的希望。
由于表皮生长因子受体(EGFR)突变率在亚洲人群晚期肺腺癌患者中的发生率高达50%[2]，且已有多个EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在我国上市并用于临床治疗，已有的"EGFR突变NSCLC治疗之中国共识"[3]和"中国NSCLC患者EGFR基因突变检测专家共识"[4]对于检测和治疗EGFR突变的NSCLC发挥了积极的指导作用。然而，随着相关研究的逐步深入，人们已经认识到除EGFR外，间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因和ROS1融合基因也分别各自代表了一类具有特定临床与病理特征的NSCLC分子亚群，从而为肺癌的治疗提供了新的分子靶点。临床研究表明，以ALK和ROS1基因改变为靶点的新型靶向药物对相应的NSCLC患者疗效显著[5,6]。而c-MET、RET和BRAF在NSCLC中的基因改变以及相应的靶向药物的治疗效果等也正在开展积极的研究和评估当中，已有的资料表明，以这些基因改变为靶点的药物同样具有显著的临床疗效[7,8,9]。另一方面，影响靶向治疗效果的耐药基因检测(如KRAS突变)也同样受到了关注。


二、NSCLC常见靶向治疗相关基因的改变


1．EGFR：
EGFR是一种跨膜受体蛋白，与细胞增殖、转移、凋亡等多种信号转导通路相关。EGFR最常见的突变为外显子19缺失和外显子21 L858R点突变，二者均为EGFR-TKI的敏感性突变；而外显子20的T790M突变与EGFR-TKI获得性耐药有关[10]。罕见突变如外显子18的G719X、外显子20的S768I和外显子21的L861Q对EGFR-TKI治疗也具有敏感性。EGFR基因突变状态是决定EGFR-TKI疗效最重要的预测因子，因此，检测EGFR基因的突变状态是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件[11]。
2．ALK融合基因：
自首次发现NSCLC中存在染色体2p的倒位，造成棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)的N端与ALK的激酶区融合产生一个融合基因之后，截至目前，在NSCLC中已确定了至少26种具有功能活性的ALK融合变异体类型；其中EML4基因与ALK的融合(EML4-ALK)为最常见的类型。ALK融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者中，其阳性检出率仅约为5%[12]。但EML4-ALK融合基因通常与EGFR基因突变不同时存在于同一患者[13,14]，在EGFR和KRAS均为野生型的肺腺癌中可出现明显的富集现象[13,15,16]。多项临床研究证实，ALK抑制剂能使ALK融合基因阳性的NSCLC患者显著获益，可用于ALK阳性的晚期或局部转移的NSCLC患者的治疗。
3．ROS1融合基因：
ROS1的基因重排被认为是另外一种不同的NSCLC分子亚群，被视为NSCLC另一重要的致癌基因，其发生率约为1%～3%[17,18]，并且常与其他重要基因改变无重叠[19]。ROS1融合基因与ALK融合基因的临床特征非常相似，提示这两种突变亚型可能有着共同的致病机制。作为ALK抑制剂的靶向药物对于晚期ROS1突变的NSCLC患者同样具有显著的抗肿瘤活性[20]。因此，2015年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南也推荐对于EGFR和/或ALK突变阴性的NSCLC患者进行ROS1检测。
4．c-MET基因：
c-MET为一种表达于上皮细胞和内皮细胞表面的受体酪氨酸激酶，可被其配体肝细胞生长因子(HGF)激活，在肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及抑制细胞凋亡方面发挥重要作用。c-MET基因的突变及扩增、蛋白质水平的表达均提示与NSCLC的预后相关，且c-MET的扩增亦可导致肿瘤对EGFR-TKI产生耐药性。在出现EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC患者中，c-MET扩增率约为11%[21]。研发针对HGF/MET信号通路的靶向药物也成为目前靶向治疗研究的一个热点，近来，有一大批针对c-MET酪氨酸激酶区的小分子药物进入临床试验[22]。
5．RET及BRAF：
RET融合基因改变多存在于肺腺癌组织中[23,24]，且往往与EGFR、KRAS突变及ALK融合基因改变不同时存在[25]。目前，已有数种多靶点分子靶向药物可能为具有RET融合基因的患者提供个体化治疗[26]，期待着大规模前瞻性的多中心随机对照临床研究加以佐证。BRAF蛋白为RAS–RAF–MEK–ERK信号通路中上游调节因子，在MAPK/ERK信号通路中起着举足轻重的作用。BRAF基因突变在白种人NSCLC中为1%～3%[27]，而在亚裔人群中其突变率相对较低[28,29]，多见于女性、吸烟患者[30]。BRAF基因突变的类型主要为V600E，约占50%以上，BRAF基因突变与EGFR、KRAS等突变相互独立、较少同时出现[31]。V600E突变可能是NSCLC的不良预后因素[32]，针对黑色素瘤BRAF(V600E)突变的靶向药物治疗研究已经取得了成效，而在NSCLC中的疗效尚有待更多的临床研究证据。


三、NSCLC靶向药物治疗相关基因检测的一般原则


1．基因检测的对象：
所有晚期的NSCLC患者，在条件许可的情况下都应当进行肿瘤组织或脱落癌细胞的EGFR、ALK突变检测，以明确靶向药物的敏感位点和可能存在的耐药情况。对EGFR和ALK突变阴性的NSCLC患者可尝试进行ROS1、c-MET、RET、KRAS及BRAF的基因检测。对于组织学已确诊但已无组织标本可用或已无法获取肿瘤组织或细胞学标本的NSCLC患者，在实验室条件和检测技术允许的情况下可尝试对其循环肿瘤细胞或血中游离DNA进行上述基因的检测。
2．基因检测的实施条件：
基因检测的实施必须在有质量保证且必须符合中国合格评定国家认可委员会(CNAS)、医学实验室质量和能力专用要求ISO15189或国家卫生和计划生育委员会病理质控评价中心(PQCC)的相关要求的场所内，由经过PQCC分子病理学组组织的系统培训或经过其他有资质的培训机构培训的技能熟练的工作人员来完成，严格按操作规程并对检测全过程实施质量控制，检测所使用的试剂和相关设备应是经中国食品药品监督管理总局(CFDA)认证的产品，瘤细胞的富集工作和最终的分子病理检测报告应由病理执业医师签发并生效。


四、NSCLC靶向药物治疗相关基因检测标本及其处理


大多数NSCLC确诊时已是中晚期，部分患者往往由于肿瘤的位置或合并症的出现，难以通过干预措施获得其肿瘤组织[33]。因此，仅有少数经手术的病例才可提供大标本，大部分病例则是通过各种小活检[纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检、超声内镜引导下的经支气管针吸活检(EBUS-TBNA)等]而完成诊断和分型的，其组织样本很小，且肿瘤细胞数量也较少。标本非常珍贵，需妥善处理，才能为必要的分子病理诊断提供保障。
1．标本的类型：
手术切除及经各种活检获取的新鲜瘤组织或经4%中性缓冲甲醛液固定、包埋后的瘤组织标本均可用于EGFR等基因检测，体液活检标本中的细胞学标本如瘤细胞数量多或经瘤细胞富集之后也可用于基因检测。循环血中的瘤细胞及血中游离的DNA作为无法获取组织标本的补充方式或用于追踪、评价靶向药物治疗效果为目的等，在有条件的实验室也可进行相关的基因检测，但应充分注意假阴性的可能。
2．标本的质量控制：
(1)标本的固定：推荐应用4%中性缓冲甲醛液对活检和手术切除标本进行固定[34]，避免使用Bouin液等含重金属离子的固定液。活检组织标本一般固定6～12 h，手术切除标本需固定6～48 h。(2)组织切片：一般需切5～10 μm的连续切片10张以满足对肿瘤细胞数量的要求，应用灵敏度高的方法时可酌情降低。切片时要有措施避免不同病例组织间的交叉污染。操作人员(或在病理医师的指导下)尽量剔除切片中的非肿瘤组织和坏死成分，以保证包含有足量的肿瘤细胞和纯度。甲醛液固定石蜡包埋的标本中会发生RNA的降解，标本储存的时间越长，其RNA获得率和纯度也会越低[35]，应引起注意。


五、NSCLC基因突变检测的常用方法


目前，用于检测NSCLC靶向药物治疗相关基因改变的方法主要有测序法(包括二代测序法)、荧光原位杂交(FISH)技术、PCR法(扩增阻遏突变系统ARMS法等)[36,37]和免疫组织化学方法等[38,39]。利用较为敏感的方法(ARMS法、数字PCR法)也可对血液中的游离DNA进行相关基因的突变检测。在有条件的实验室也可利用特殊设备对循环血中瘤细胞进行相关基因的突变检测。进行基因检测时应根据组织标本的类型和实验室条件选择合适的检测技术，标本的质量控制应由有经验的病理医师负责，当怀疑一种技术的可靠性时，可以采用另一种技术加以验证。无论采取哪种检测方法，所使用的检测试剂(应包含所有公认的敏感位点及耐药位点)和设备均应为经CFDA批准的产品。


六、NSCLC患者常见靶向治疗相关基因检测流程


手术或经各种活检获取的组织及细胞学标本应首先对其EGFR、ALK及KRAS基因进行检测，EGFR突变阴性的患者中可出现ALK阳性患者的富集，免疫组织化学法是筛查阳性率较低的ALK的重要方法之一，但不能确定者仍需经其他方法再确认；无法获得组织或细胞学标本时，可采集外周血标本作为补充，建议选择较为敏感的方法检测血中游离DNA中相关基因的改变，亦可使用专用设备对循环血中肿瘤细胞进行相关基因检测(图1)。



七、NSCLC基因检测报告


NSCLC靶向治疗相关基因检测报告的内容应包括检测的结果(包括明确的病理诊断和专业的书写)及对结果的诠释，且能够被肿瘤科医师或其他非病理专业的医师所理解。具体内容应涵盖患者及标本的基本信息、DNA质量、检测方法、检测试剂及仪器、检测结果的相关临床意义，以及在检测过程中出现的状况及不确定结果和因素，以供临床医师全面参考。
所有专业化分子病理检测实验室，通过建立高效率的分子检测平台，优化检测流程，从接收标本到发出报告周期，建议不超过5～7个工作日，以及时满足临床的需求。


八、未来展望


利用肿瘤细胞在凋亡、坏死过程中释放至血液中的肿瘤DNA为理论基础的液体活检技术，作为组织/脱落细胞学基因检测的补充受到了高度重视。它不仅能给予那些没有肿瘤组织/脱落细胞标本的晚期NSCLC患者以进行EGFR等突变检测和进一步靶向药物治疗的机会，而且血液检测可动态监测肿瘤标志物的变化，特别是耐药突变T790M的出现，以便及时调整治疗策略[40]。基于ARMS平台优化后的方法检测血中游离DNA中EGFR的突变业已获得CFDA批准而服务于临床，而具有更高灵敏度的数字PCR方法也在研究和探索中[40,41]，相信通过不断的摸索和经验的积累，会很快获得突破性的进展，服务于临床需要。
二代测序技术扩展了基因突变检测的深度和广度[42]，也使得一次性完成NSCLC靶向治疗相关的多个重要基因的检测成为可能，但需要积累经验和临床数据并获得CFDA的批准。扩大的基因检测项目应仅限于研究，不能用于临床常规项目检测。
应用免疫组织化学方法间接筛查NSCLC靶向治疗相关基因的改变一直在探索之中，许多的研究和报道中显示了其基因和蛋白表达的一致性，但总是有一定比例的假阳性或假阴性的存在。主要的问题在于缺少统一的阳性判定标准和需要进一步经过其他方法进行验证的标准，并且多数用于检测的抗体也未获得CFDA的批准。但随着数据的扩大和经验的积累，应用免疫组织化学法初筛NSCLC的靶向治疗相关基因的改变也是可能的。


End
总之，我们在利用好现有成熟的技术和合规的产品基础上，期待着多元化的基因检测平台及技术的不断发展与进步，使非小细胞肺癌患者的靶向治疗相关基因检测实现从定性到定量、从静态至动态、从单基因到多基因/基因组/外显子组的检测，从而推动非小细胞肺癌精准靶向药物治疗的不断进步。

xiaofeng

谢谢分享