Cas9稳定表达人肿瘤细胞株的建立及其基因编辑活性

阳光56

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CRISPR/Cas9技术是目前最有效的基因编辑技术，只需要2个元件——导向RNA(gRNA)序列的引导和核酸内切酶Cas9蛋白的作用，就可以在基因组的特定位点进行DNA双链切割，从而造成基因组DNA特定位置的缺失、激活、突变。CRISPR即成簇的、规律间隔的短回文重复序列(cluster regularly interspaced short palindromic repeats)，Cas为CRISPR相关蛋白(CRISPR associated protein)。鉴于CRISPR/Cas9技术的简便、高效和特异，国内外很多的实验室开始利用该系统进行相关研究，已成功在人、小鼠、大鼠、线虫、斑马鱼等多个物种的细胞中实现了基因组DNA的编辑[[url=]1[/url],[url=]2[/url],[url=]3[/url],[url=]4[/url]]。为了更方便地利用这项技术研究肿瘤发生发展机制及寻找治疗方法等，我们将Cas9蛋白引入多种人肿瘤细胞系，建立Cas9稳定表达的人肿瘤细胞系，后续只需向这些细胞中导入gRNA即可轻松实现目的基因的编辑，研究该基因的功能。

材料与方法

1．细胞及培养基：

本研究中所使用的细胞系及相应培养基均来自国家实验细胞资源共享平台中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。细胞系包括人胚肾细胞(293T)、人结直肠癌细胞(HCT116)、食管癌细胞(EC109)、胃癌细胞(MKN-45)、胰腺癌细胞(PANC-1)、肾透明细胞癌细胞(Caki-1)、前列腺癌细胞(PC-3、Du145)、卵巢癌细胞(SK-OV-3)、子宫颈癌细胞(HeLa)、子宫内膜癌细胞(HEC-1-B)、黑色素瘤细胞(A375)、肺癌细胞(NCI-H1975、A549)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF-7)，均为贴壁细胞，按照平台所示培养条件，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养。

2．质粒：

Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro及gRNA表达质粒pLL3.7-U6-sgRNA-EGFP质粒由中国医学科学院基础医学研究所李利民教授课题组馈赠。其他相应的慢病毒包装质粒由本实验室保藏。

3．病毒包装、感染：

以293T为病毒包装细胞，按常规方法包装分别得到含有Lv-EF1α-Cas9-Flag-Neo和Lv-EF1α-Cas9-Flag-Puro的病毒上清。分别用这2种病毒上清感染上述15种来自不同组织的肿瘤细胞，加入相应药物(400 mg/L G418或2 mg/L Puromycin)筛选，挑选单细胞克隆，用于后续检测。

4．Western blot检测Cas9蛋白的表达：

将挑选出来的Cas9阳性细胞株扩增，提取总蛋白，按照常规Western blot的方法通过Flag标签抗体(Sigma公司，1∶2 000)检测Cas9-Flag融合蛋白的表达情况。

5．pLL3.7-TSC22-gRNA-EGFP质粒的构建：

为验证细胞系中稳定表达的Cas9蛋白的功能，利用CRISPR设计工具http：//CRISPR.mit.edu/，设计了4条针对基因TSC22的寡核苷酸，用于构建gRNA表达载体。1号位于TSC22基因Watson链、第1个外显子区、起始密码子ATG的附近，2～4号位于Crick链，分别在第1个、第2个、第3个外显子区([url=]图1[/url])。gRNA的寡核苷酸序列见[url=]表1[/url]。按照文献报道方法构建gRNA表达质粒[[url=]5[/url]]，获得pLL3.7-TSC22-gRNA-EGFP-1、-3、-4三个质粒，-2号测序未成功。

表1 TSC22 gRNA寡核苷酸序列

图1

靶向TSC22的导向RNA寡核苷酸的设计示意图

6．Cas9/CRISPR技术敲除TSC22基因：

向MDA-MB-231-Cas9-Neo-2、HeLa-Cas9-Neo-19及HCT116-Cas9-Puro-A5三个细胞株共转染pLL3.7-TSC22-gRNA-1、-4或者-1、-3两个质粒([url=]图1[/url])。转染96 h后通过流式细胞仪筛选EGFP阳性细胞，铺板、挑选单克隆。

7．TSC22基因敲除情况的检测：

将挑选出来的转染了TSC22 gRNA的细胞株扩增，提取基因组DNA，在缺失片段上下游设计引物(上游引物：5′-TCTCCCTGGGCTGCGGAAAGCCAGAAGATTTTATCT-3′；下游引物：5′-GACTGTGGAGGCAGATTCTCCC-TAGCACATCTTCTCCG-3′)，进行基因组PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收后测序，确定片段缺失情况。挑选存在DNA片段缺失的克隆，提取细胞总蛋白，通过Western blot检测TSC22(一抗1∶1 000，OriGene公司)的表达。

结果

1．细胞感染、克隆筛选得到的细胞中Cas9-Flag蛋白的表达情况：

15种人肿瘤细胞，分别感染携带2种抗性的Cas9表达质粒，经过新霉素或嘌呤霉素筛选，挑选克隆，通过Flag标签抗体检测Cas9-Flag融合蛋白的表达情况，每种肿瘤细胞挑选3至5个克隆。在挑选的69个肿瘤细胞株中均存在相对分子质量150 000的阳性条带([url=]图2[/url])，即均有Cas9蛋白的稳定表达。这69个细胞株见[url=]表2[/url]，其中有新霉素抗性的细胞57株，嘌呤霉素抗性的细胞12株。

表2 Cas9稳定表达的69株人肿瘤细胞株

图2

Western blot检测稳定转染细胞株中Cas9-Flag蛋白的表达情况

2．Cas9蛋白对TSC22基因的编辑作用：

分别向MDA-MB-231-Cas9-545、HeLa-Cas9-532及HCT116-Cas9-567三个细胞株共转染pLL3.7-TSC22-gRNA-1、-4或-1、-3两个质粒，后经流式细胞术分选、铺板，分别挑选了多个克隆。经过基因组PCR、测序发现有43个克隆出现了基因组DNA大片段的缺失([url=]图3[/url]，[url=]图4[/url]；[url=]表3[/url])。组1中，同时转染pLL3.7-TSC22-gRNA-1号、3号两个质粒，理论上可以成功切除约514 bp的片段，从切除位点上下游设计引物进行PCR可以得到1 673 bp的条带；组2中，同时转染pLL3.7-TSC22-gRNA-1号、4号两个质粒，成功切除约1 856 bp的片段，PCR可以得到331 bp的条带；而野生型的细胞应该可以扩增出2 187 bp的片段。从基因组PCR的结果来看，很多克隆同时出现了野生型的片段和突变后的小片段，提示这些克隆可能挑选不纯，混杂有野生型细胞，或者仅发生了单等位基因的缺失(monoallelic deletion)。将这43个克隆进行Western blot检测，发现有些克隆TSC22表达仅是降低，也提示该克隆为混杂克隆。综合基因组PCR和Western blot检测的结果，克隆HCT116-Cas9-TSC22KO-569及231-Cas9-TSC22KO-553为TSC22基因纯合缺失克隆([url=]图5[/url])。

表3 gRNA作用后Cas9稳转细胞株突变克隆情况统计

图3

基因组PCR检测导向RNA作用后挑选的单克隆中TSC22基因片段缺失的情况

图4

测序验证导向RNA作用后挑选的单克隆中TSC22基因片段缺失的情况

图5

Western blot证明导向RNA作用后挑选的单克隆中TSC22蛋白的表达缺失情况

讨论

CRISPR/Cas是一种在细菌和古细菌中发现的免疫防御机制，用于清除入侵的病毒或其他外源DNA[[url=]3[/url],[url=]5[/url]]。在细菌中，CRISPR/Cas系统分为3型(TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，而来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR/Cas9系统最为简单，为Ⅱ型的CRISPR。Cas9蛋白为核酸内切酶，含有2个核酸酶结构域，分别切割DNA的2条单链。Cas9蛋白要发挥定点切割的作用，还需要2种RNA的帮助，即crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)。两种RNA通过碱基配对形成tracrRNA/crRNA复合物，引导Cas9蛋白到达与crRNA配对的序列靶位点。Cas9通过识别保守的间隔相邻基序(proto-spacer adjacent motifs，PAM)序列结合在DNA上，对目的DNA双链进行切割，造成DNA双链的断裂。此后，细胞会利用非同源末端连接(non-homologous end joining)和同源重组(homologous recombination)两种修复机制对双链断裂的DNA进行修复，这样可以高效地对基因进行编辑，实现双等位基因或多等位基因的完全敲除，或者是插入新的遗传信息[[url=]3[/url],[url=]5[/url],[url=]6[/url]]。而通过人工设计这2种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA，足以引导Cas9对DNA的定点切割。

目前，经过基因工程改造，2种RNA分子crRNA和tracrRNA被组装成一条嵌合RNA——gRNA，长度不超过100 bp，这种gRNA足以帮助Cas9蛋白进行定点切割。另外，PAM序列结构简单(5′-NGG-3′)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点。基于以上几点，优化了的CRISPR/Cas9系统操作简单、作用广泛、靶向精确、切除高效，大小实验室均可利用该系统轻松在细菌、植物、线虫、斑马鱼、哺乳动物等细胞中实现基因编辑[[url=]7[/url],[url=]8[/url],[url=]9[/url]]。利用Pubmed搜索主题词CRISPR/Cas9，截至2016年5月有1 707篇论文发表。

现在使用的CRISPR/Cas9系统只需要2个元件——Cas9蛋白和gRNA，在应用中多是将这2个元件构建在同一载体中，一起转入细胞中。在此后的筛选中，先确认Cas9的表达，再筛选基因突变的克隆，而且在不同的克隆中由于Cas9插入位点的不同，Cas9的表达水平也不同，这样不利于进行大规模的筛选。我们在本研究中将CRISPR/Cas9系统中的2个元件分离开来，首先通过慢病毒感染的方式将带有Cas9-Flag融合蛋白基因的载体转入细胞中，建立了一批Cas9稳定表达的肿瘤细胞株。考虑到CRISPR/Cas9技术在人类肿瘤研究中应用的广泛性，我们从北京协和医学院细胞资源中心现保藏的细胞中选取了来自12个组织的15种肿瘤细胞进行了病毒感染。另外，针对每种细胞都分别采用了两个Cas9的表达载体——新霉素和嘌呤霉素抗性，以便后续进行基因编辑时更具选择性。经过相应的抗生素筛选，得到了许多阳性克隆，经挑选、扩增后，提取细胞总蛋白通过Western blot检测Flag标签的表达，进而确定Cas9表达阳性的克隆([url=]图2[/url])。最终，本研究获得了69个Cas9稳定表达的阳性克隆，其中57个为新霉素抗性，12个为嘌呤霉素抗性。

随后，我们验证了Cas9蛋白的功能，以TSC22[transforming growth factor-β (TGF-β)-stimulated clone-22，也称TSC22D1.2]基因为靶点，利用CRISPR技术实现基因敲除。利用张峰实验室提供的CRISPR设计工具http：//CRISPR.mit.edu/，我们设计了4条针对基因TSC22的寡核苷酸，与PAM结构(5′-NGG-3′)毗邻，每条约20个核苷酸，作为crRNA中与切割靶点特异性配对的部分。化学合成4对寡核苷酸，经克隆测序鉴定成功获得了3个TSC22 gRNA的表达载体pLL3.7-TSC22-gRNA-1、3、4号，2号在构建时获得了多个生长状态良好的克隆，但是测序无信号，考虑是该质粒中gRNA的序列形成了复杂的二级结构而影响测序，在本研究中未使用2号质粒。gRNA的表达载体可以单个或成对转入Cas9表达的细胞中，为了获得基因大片段缺失的细胞，我们采取的是同时转入两个不同的gRNA载体，能将HCT-116-Cas9-567、MDA-MB-231-Cas9-545和HeLa-Cas9-532中高表达的TSC22基因成功切除。同时导入2个gRNA，造成2个序列特异性的双链断裂(double strand breaks)，可以引起断点间的基因片段缺失、基因倒置或者单一位点的缺失等突变[[url=]5[/url]]，我们只检测了第一种的情况。通过基因组PCR及测序发现，有43个克隆出现了大片段的基因缺失，提示Cas9蛋白已经发挥了功能，CRISPR技术实现了基因编辑。不同的细胞CRISPR突变的效率不同，考虑与gRNA的瞬时转染效率有关。不同的细胞质粒转染的难易程度不同，相应进入细胞中的gRNA的量也不同，基因突变的效率也有差异。另外，有文献报道在哺乳动物细胞中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，敲除的效率与缺失片段的大小成反比，即缺失片段越大，越难获得突变克隆[[url=]5[/url]]。

作为基因编辑技术，CRISPR/Cas9简单、高效，仅需要几周的时间就可以获得大片段基因缺失的突变细胞株，有报道缺失片段甚至可达1 026 kb[[url=]5[/url]]。但是也存在其局限性，即脱靶效应。Cas9核酸酶切酶的作用是非特异性的，尤其在Cas9和gRNA组成性存在时，会在全基因组非靶点区域出现非特异性切割。为了提高CRISPR/Cas9技术的特异性，Hsu等[[url=]10[/url]]对脱靶效应进行了系统、全面的分选，提出利用计算机模型和调整gRNA量的方法来降低或消除脱靶效应。我们即利用Hsu等[[url=]10[/url]]开发的设计软件选取gRNA序列。提高gRNA的量可以提高突变率，但同时也会带来脱靶效应，所以我们在gRNA载体的导入采取了瞬时转染的方法而非病毒感染，以降低gRNA持续性表达带来的脱靶效应。另外，Ran等[[url=]11[/url]]还设计了突变型的Cas9蛋白——Cas9切口酶(Nikase)，利用成对的gRNA引导在DNA的相邻位置形成双切口，将细胞内的脱靶效应降低了50～1 500倍。

总之，我们通过慢病毒感染的方式建立了69个Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，后续各实验室只需要根据课题需要设计所研究基因的gRNA进行瞬时转染，即可实现目的基因的突变，研究基因功能。操作简便、快速、特异。另外，目前有的实验室已经建立了gRNA文库，可以实现全基因组范围内的基因突变[[url=]1[/url],[url=]12[/url]]。此时建立稳定表达Cas9细胞系更为重要，一是让后续操作更加简单，二是每个突变细胞内Cas9的表达一致，更容易挑选到真阳性的克隆。所以，我们建立的Cas9稳定表达的克隆在大规模药物筛选、新药作用靶点的筛选以及基因功能检测等方面具有非常重要的意义。

• [url=]卞晓翠[/url]
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中华病理学杂志, 2017,46(01): 43-48.

xiaofeng

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