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在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合；同一切片的再度染色法（先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照）；两种酶标抗体3又重染色（分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体。用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色）；不同种属来源的抗体双重染色。目前，最常用的是最后一种方法。
[align=center][align=center][align=center]  [/align][/align][/align] 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、免疫荧光技术注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
（1） 阳性对照：阳性血清 荧光标记物；
（2） 阴性对照：阴性血清 荧光标记物；
（3） 荧光标记物对照：PBS 荧光标记物。
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发表于 2017-12-20 17:54:18
