酶组织化学——胆碱酯酶显示法

小王

　　胆碱酯酶属于特异性酯酶，分两类：一类为乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE，EC3.1.1.7），又称真性胆碱酯酶，主要存在于神经元胞质内、运动终板处、肌肉及红细胞中；另一类为假性胆碱酯酶（pseudocholinesterase，chE，EC3.l.1.8），主要存在于血浆、胰腺、唾液腺内。

　　两者均属神经系统中羧基酯酶，但化学性质不同。AchE水解乙酰胆碱，也分解乙酰基β-甲基-胆碱，但不能分解苯甲酰基胆碱，同时此酶能被高浓度的乙酰胆碱所抑制，而chE不能水解乙酰胆碱。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标，所以显示该酶可作为胆碱能传递部位的标志。有机磷中毒可使该酶活性受抑制。用于显示乙酰胆碱酯酶的方法是亚铁氰化铜法。

　　【基本原理】

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　　【试剂配制】

　　1、0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH5.5）；

　　2、0.1mol/L柠檬酸钠液柠檬酸钠194mg，蒸馏水10ml；

　　3、30mmol/L硫酸铜液硫酸铜75mg，蒸馏水10ml；

　　4、5mmol/L铁氰化钾液铁氰化钾16.5mg；蒸馏水加至10ml；

　　5、孵育液 碘化乙酰硫代胆碱5mg，蒸馏水1ml，0.1mol/L柠檬酸钠液0.5ml，0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH值5.5）；6.5ml，硫酸铜液1ml，铁氰化钾液1ml。 将碘化乙酰硫代胆碱溶于蒸馏水，加入醋酸盐缓冲液，完全溶解后再依次加入其它。

　　【染色步骤】

　　1、新鲜组织恒冷箱切片4-8um，贴于盖玻片上风干；

　　2、入孵育液37℃1-2h至切片呈淡棕色即可；

　　3、如镜下观察阳性物质色浅，可蒸馏水洗后继续入孵育液作用至适宜为止；

　　4、蒸馏水洗；

　　5、甘油明胶封固。

　　【结果】乙酰胆碱酯酶活性部位呈红棕色或深棕色。

　　【对照】

　　1、在孵育液中加入10-5mol/L的毒扁豆碱，可同时抑制AchE、chE活性；

　　2、用10-6mol/L二异丙基氟磷酸37℃处理30min，水洗后再入孵育液，或在孵育液内加入10-5mol/L四异丙基焦磷酰胺，二者均可抑制chE而显示AchE。

　　【注意事项】

　　1、配好的孵育液应透明淡绿色，如出现混浊则不能使用；

　　2、孵育时间不宜过长，否则背景不清晰。
 

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