【Nature】TRACERx研究揭秘ctDNA系统进化：早期肺癌如何演变？

为止

　　诸多研究表明肿瘤异质性是导致晚期肿瘤发生耐药、进展的始作俑者。迫于系统性治疗药物的选择压力，肿瘤细胞不断发生基因突变而分化为不同的亚克隆群体。那么，考虑到其形态和基因异质性均较高，早期肺癌的动态血ctDNA会有怎样的基因改变来驱动肿瘤进化以暗度陈仓呢？近期，英国Charles Swanton教授在Nature发表了TRACERx研究（TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy Therapy [Rx]）入组前100例患者的分析结果，或许能够拨云见日、供我们一窥早期肺癌的进化模式。

　　研究背景

　　晚期转移性NSCLC并未能从系统性化疗中获益较多，而术后辅助化疗可延长可手术肺癌的总生存率约5%。这种生存获益可能源于肿瘤体积小、其瘤内异质性也较低。既往研究发现，乳腺癌、直肠癌术后血浆ctDNA检测能够在任何提示转移的临床指标出现之前而鉴别出术后可能复发转移的患者，从而及早制定相应的干预措施、改善患者生存。作为前瞻性研究肿瘤进化机制的多中心临床试验，TRACERx研究基于多区域、动态采样，使用多通道PCR二代测序方法（NGS）检测肿瘤组织和ctDNA基因谱改变，从而揭示了早期肺癌及其术后复发过程中的肿瘤种系变化框架。

　　研究方法

　　详见Swanton教授团队介绍TRACERx研究方案的参考文献[1]。

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　　研究结果&讨论

　　肿瘤组织与血浆ctDNA的克隆、亚克

　　隆SNV分析

　　首先，研究检测了入组96例早期肺癌患者的术前血浆中ctDNA基因谱以寻找ctDNA阳性突变的临床病理因素（另外4例患者的血浆无法检测ctDNA）。每例病人的个体化检测基因Panel是基于其肿瘤组织的基因谱改变而设计的，其均位为18个SNV，包括克隆、亚克隆SNV。48%（46/96）的患者至少含有2个SNV，另外12例患者检测出1个SNV。分析显示，ctDNA的检测与肺癌的病理亚型相关。97%的肺鳞癌（30/31）、71%的其他NSCLC亚型（5/7）检测ctDNA阳性，而肺腺癌的阳性率仅为19%（11/58），提示ctDNA的释放可能与肺鳞癌较易发生瘤内坏死相关。单因素分析显示，肿瘤坏死、淋巴结转移、淋巴血管浸润、肿瘤大小、Ki67指数、病理为非腺癌、总cfDNA摄入等与ctDNA检测阳性相关。而多因素分析显示，病理为非腺癌、淋巴血管浸润、Ki67指数高为其独立预测因子。此外，研究者对比了PET/CT检查显示的肿瘤组织FDG摄入量，结果显示其AUC为0.84（P<0.001，n=92），提示肿瘤细胞的增殖活性可预测ctDNA阳性。

　　46例ctDNA阳性患者的ctDNA克隆、亚克隆SNV分布的分析显示，100%均存在克隆SNV且每例患者可检测到Panel中94%（11%-100%）的克隆SNV，87%（40/46）患者存在亚克隆SNV且每例患者可检测到Panel中27%（0%-91%）的亚克隆SNV。克隆SNV分析显示，其等位基因变异频率（VAF）高于亚克隆SNV（P<0.001，n=27），提示检测ctDNA的克隆基因改变更为敏感。其中，可供CT检测肿瘤体积的38例患者的分析显示，肿瘤体积与血浆平均克隆SNV的VAF相关（P<0.001，n=38）；而二者的相关性模型显示，10cm3大小的原发肿瘤可导致0.1%（95% CI=0.05to0.17%）的血浆克隆SNV的VAF。假设1cm3的肿瘤组织包含9.4x107个肿瘤细胞，0.1%的血浆VAF则提示NSCLC原发肿瘤负荷为3.26亿个肿瘤细胞。而亚克隆SNV分析显示，57个共有亚克隆突变（可于至少两个肿瘤区域中检测阳性）中、有35个在血浆ctDNA中阳性，而80个特有亚克隆突变（仅有一个肿瘤区域中检测阳性）中、仅有26个在ctDNA中阳性。其血浆ctDNA的亚克隆SNV阳性的患者，其预测肿瘤体积明显较高。由此可见，原发肿瘤的亚克隆负荷与血浆亚克隆SNV检出率呈正相关。

　　动态血浆ctDNA检测提示肿瘤复发征象

　　研究者动态检测了早期NSCLC患者术前、术后的血浆ctDNA状态，并纳入14例证实肿瘤复发和10例无复发病人（中位随访期775天）。该部分研究根据不同的肺癌病理类型而扩大了ctDNA检测的Panel范围。14例复发病人中，13例患者在临床确诊复发前即在动态ctDNA中检测到至少两个SNV；而仅有1例无复发患者的血浆ctDNA检测出两个以上SNV。结果显示，肿瘤复发的前置周期（lead-time，即从ctDNA检测复发阳性至临床CT影像确认肿瘤复发的时间段）为70天（中位值，范围10至346天）。3例患者在术后30天内即检测ctDNA阳性，其基因谱可反映肿瘤对辅助化疗的耐药性；且动态监测结果显示，即便在辅助治疗周期内，其血浆SNV负荷也仍不断升高，并在术后1年内出现复发。与此相反，另有1例患者，虽术后3天、辅助化疗前均有ctDNA检测阳性，但辅助治疗完成后以及术后457天、667天均检测阴性，而术后688天时仍无肿瘤复发。由此可见，动态血浆ctDNA检测能够及早检测肿瘤复发征象，并能在克服瘤内异质性干扰的情况下有效选择治疗靶点。

　　另外，研究者将血浆ctDNA的亚克隆SNV检测阳性的患者与其原发灶的基因测序结果进行聚类；其中与克隆SNV的VAF相近的亚克隆SNV纳入同一种系进化分支。结果显示，存在某一亚克隆为分支优势而驱动肿瘤复发的可能。

　　肿瘤系统进化特征

　　为进一步研究血浆ctDNA亚克隆分析，研究者同时综合对比了原发灶、转移灶的多点测序结果。首先，血浆ctDNA基因谱改变能够提示原发灶低频突变、预测转移灶来源等。编号CRUK0063病人，其术后231天内连续4次检测血浆ctDNA中一亚克隆突变阳性OR5D18，这可追溯至其原发肿瘤区域3所特有的亚克隆分支。而术后467天时，椎旁转移灶的基因测序结果显示，含有OR5D18突变的亚克隆分支是导致肿瘤转移的优势克隆。椎旁转移灶包含88个在原发灶检测中阴性的SNV，而以一个更低的SNV检测阈值重复检测原发灶时，可检测到其中的16个SNV，包括一个驱动停止获得的SNV，ARID1A；但在该病人的其他原发肿瘤区域仅检测出2个SNV。由此可见，血浆ctDNA能够捕捉到转移灶是起源于原发灶何种突变频率较低的亚克隆SNV。编号CRUK0035患者，有两个肝转移灶和一个肾上腺转移灶。其基因测序结果显示，在原发灶可测得的149个克隆SNV中，肝转移灶中仅有109个，提示有部分原发灶的突变分支未能进入血液系统；而术后ctDNA基因谱则不仅检测出肝转移灶的所有克隆SNV，也检测出了存在于原发灶而肝转移灶阴性的亚克隆分支。其次，纵隔淋巴结转移灶的基因测序结果也能辅助确认血浆ctDNA的克隆、亚克隆突变。第三，ctDNA中SNV负荷和突变频率的动态变化能够提示术后辅助化疗的敏感性及应答效果。

　　转移灶的ctDNA基因突变谱

　　编号CRUK0063患者同时入组了PEACE试验，于死后尸检时检测所有转移病灶的基因突变频谱。其原发灶、术后467天的椎旁转移灶、术后857天尸检取出的6个瘤灶（包括主动脉旁、椎旁、肺内转移灶）均纳入肿瘤系统进化结构的分析。结果显示，7个转移灶均起源于原发灶中的同一亚克隆祖先，即种系发生聚类8。其中6个转移灶区域也共有同一晚期的种系发生聚类12；另一不含聚类12的病灶为主动脉旁转移灶，其包含一特有的亚克隆，聚类9。

　　研究者设计了一个ctDNA assay panel以回顾性追溯该肿瘤的转移亚克隆负荷，每个时间点检测103个SNV。术后151天时检测出其中2个克隆SNV；术后242天时检测出一个新的亚克隆SNV，即图中的聚类8；术后466天时，出现胸椎旁转移灶，此时共有聚类8、11、12包含的的20个亚克隆SNV中，血浆ctDNA中可检出的18个，另包括特有聚类5、9中的2个亚克隆SNV。然而，术后467天时椎旁转移灶活检组织中并未检测出上述亚克隆SNV。由此可见，血浆ctDNA所提示的亚克隆SNV层级负荷，与原发灶多点测序的系统进化推断相一致。克隆SNV的VAF在术后姑息放化疗中有所降低，但在术后767天时开始升高。死亡前90天时，血浆ctDNA才能够检测的聚类5、9和2中的其余SNV；而这三组聚类中的SNV属于主动脉旁转移灶所特有的亚克隆。

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　　点评

　　本研究发现了ctDNA检测阳性的若干预测因子，如病例为肺腺癌、肿瘤坏死、肿瘤增殖指数高、淋巴血管浸润等。肿瘤体积与血浆ctDNA中克隆SNV的VAF呈正相关。10cm3大小的原发肿瘤可导致至少0.1%（95% CI=0.05to0.17%）的血浆克隆SNV的VAF，也可由此借ctDNA的突变负荷和突变频率推断肿瘤体积。ctDNA检测复发阳性可比临床CT影像确认肿瘤复发提前70天。与此同时，Swanton教授发表于NEJM的文章公布了TRACERx研究入组前100例患者的原发肿瘤瘤内基因异质性结果，提示基因组倍增及动态变化的染色体不稳定性与瘤内异质性相关，并导致驱动体细胞拷贝数变异“镜像”演化的平行进化模式。尽管TRACERx研究所倡导的诊疗模式将给病人带来极大的经济负担，但在目前探索性研究阶段，液体活检在预测治疗应答、早期诊断疾病复发、实时动态检测肿瘤进化等方面存在极高的研究价值。

　　参考文献

　　1 Jamal-Hanjani M, Hackshaw A, Ngai Y, et al. Tracking genomic cancer evolution for precision medicine: The lung TRACERx study. PLOS BIOL. 2014; 12: e1001906.