15例肺腺癌存在ALK、RET、ROS1或MET共突变

阳光56

摘要

　　肺癌的驱动基因EGFR、ALK、RET、ROS 1和MET通常是相互排斥的。很少具有EGFR突变和ALK重排共存、或者EGFR突变和RET或ROS1重排共存的情况。本次研究中报告了15例肺腺癌患者（3例男性，12例女性；其中14例白种人，1例非裔美国人），年龄43~81岁（中位年龄60岁），他们同时存在两种基因改变，包括ALK、ROS 1、RET重排或MET扩增。通过FISH检测发现有4例有ALK与ROS1重排共存、3例有ALK与MET共存、1例有ALK与RET共存、4例有RET与MET、2例有RET与ROS 1、1例有ROS 1与MET。四个基因发生频率相近，ALK和MET为53%（8例），RET和ROS 1为47%（7例）。二代测序同时发现了其他基因突变，如：TP53（6例）、EGFR（5例）、KRAS（3例）和STK 11（2例）。9例患者有吸烟史，6例无吸烟史。本研究表明肺癌有必要进行多基因同时检测。鉴于该类基因突变均已有对应靶向药物，因此同时应用多种靶向药治疗可能使这一组罕见肺癌患者受益。

　　前言

　　肺癌是美国和其他国家癌症相关死亡的最常见原因。酪氨酸激酶抑制剂如针对表皮生长因子受体（EGFR）突变（如厄洛替尼）、间变性大细胞淋巴瘤激酶（ALK）基因重排（如克唑替尼）的发展极大地改善了肺癌患者的预后，一些新的具有酪氨酸激酶功能的致癌融合基因也被发现，如RET和ROS 1以及融合基因合并MET扩增。针对上述分子异常的酪氨酸激酶抑制剂已进入临床试验，如凡德他尼（RET抑制剂）。既往研究认为肺癌驱动基因的激活突变是相互排斥的。然而，最近报道了一组患者中EGFR和ALK改变并存，进一步研究表明，加用ALK 抑制剂治疗可改善这组患者的总体生存率。 据报道，少数病例中可检出EGFR合并ALK以外的基因异常（如ROS1），但是据我们所知，尚未发现肺癌中并存ALK、RET、ROS1或MET改变。本研究中，我们报告了15例肺腺癌患者，伴有ALK、RET、ROS1或MET中两种基因异常，其中5例合并EGFR突变。

　　材料与方法

　　检索德克萨斯大学MD安德森癌症中心临床细胞遗传学实验室的数据库，用荧光原位杂交技术（FISH）评估肺癌病例中ALK、RET、ROS1或MET的异常。
　图1：ALK，RET，ROS 1重排和MET扩增的代表性阳性信号模式。（a）ALK基因重排的组织FISH试验（病例6）。阳性细胞用箭头标记。有两种阳性信号模式（1R1G1F表示ALK基因重排，1R1F表示5’-ALK缺失的ALK基因重排（绿色信号））。（b）RET基因重排的组织FISH试验（病例14）。三个分裂信号型阳性细胞（1R1G1F）用箭头标记。（c）ROS 1基因重排组织FISH试验（病例6）。两个分裂信号+多个融合信号模式的阳性细胞（1R1G6~7F）用箭头标记。同时还发现，高比例的间期细胞表现为单一融合（1F）或多融合（3~8F）信号模式。这些细胞群的临床意义尚不清楚。（d）MET基因扩增的组织FISH试验（病例6）。显示了三个具有5个以上MET信号的典型细胞。

　　荧光原位杂交

　　所有组织采用福尔马林固定，石蜡包埋切片，并根据美国医学遗传学和基因组学指南对这些标本进行验证。我们利用FDA批准的LSI-ALK双色分离探针检测ALK重排。该探针与2p23（着丝粒侧的绿色光谱和ALK断点端粒侧的橙色光谱）杂交。我们对50个细胞核进行常规分析，如果计数结果不确定，则将分析扩展至100个细胞核。我们实验室已经确立了以下阳性信号的界值：＞25个阳性信号/每50个细胞核，或＞15%阳性信号/每100个细胞核。（图1a）

　　本研究使用CymoGen DX 公司Clear-View双色分离探针检测RET重排。探针与10q11.21带杂交（着丝粒侧为红色，RET断裂端粒侧为绿色）。每例选取200个间期细胞核计数。在95%置信度下（P＜0.05）RET重排阳性的临界值为：一红一绿一融合（1R1G1F）信号模式（RET重排阳性）＞7.9%；一绿一融合（1G1F）模式（RET重排阳性伴5’缺失）＞3.1%。一红一融合（1R1F）模式＞4.4%，表明3’缺失，临床意义不明。（图1b）

　　本研究使用XT ROS 1双色分离探针检测ROS 1重排。该探针与6q22杂交（着丝粒侧为红色，ROS1断裂端粒侧为绿色）。 每例选取200个间期细胞核计数。在95%置信度下（P＜0.05）ROS1重排阳性的临界值为：以下三种信号模式中任一种均＞3.5％：一红一绿一融合（1R1G1F）信号模式（ROS1重排阳性），一红一融合（1R1F）信号型（ROS1重排阳性伴5’缺失）。一绿一融合（1G1F）信号模式的临界值为＞3.5％，表明3’缺失，临床意义不明。（图1c）

　　本研究使用CymoGen DX MET/CC 7 DNA探针试剂盒检测MET扩增。MET探针（红色）特异于MET位点（7q31），CC7探针（绿色）特异于7号染色体着丝粒区的α卫星DNA序列（7p11.1-q11.1）。每例计数60个间期细胞核。MET扩增阳性的标准为：①MET：CC7比值≥2.0；②MET：CC7比值＜2.0，但每个细胞平均MET信号计数≥5；③超过10%的肿瘤细胞显示≥20拷贝的MET信号或信号簇（图1d）。

　　在ALK，ROS1，RET基因的FISH检测中常见1R1G≥2 F的信号模式，此为完整基因的获得或扩增所致，也可认为是阳性结果，（如图1a和c），但其临床意义尚不明确。

　　二代测序

　　从肿瘤组织中提取DNA后，我们用Ion Torrent PGM和Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel进行了靶向二代测序。本研究对多数病例检测了50基因热点突变，而对新近病例进行了更大范围的128基因热点检测。

　　结果和讨论

　　自2010年2月至2016年底，本实验室对5206例原发或转移性肺癌患者进行了包括ALK，RET，ROS 1重排或MET扩增在内的FISH检测。其中1251例（24%）检测了四项，609例（12%）检测三项，768例（15%）检测两项，2578例（50%）检测一项。阳性率为：ALK为7%（238/3382例），ROS1为2%（32/1782例），RET为1%（33/2379例），MET为5%（177/3398例），这与一项对1139名中国肺癌患者的研究结果非常相似。 阳性病例中，15例（表1）存在两种基因重排，包括ALK、RET和ROS1重排和/或MET扩增。这些病例中有14例检测了4种基因，而例5则检测了3种基因（非RET）。因此，在本研究中若列入检测两个或两个以上基因的病例，双阳性率约为0.6%（15/2628例），若列入4个基因病例则阳性率高达1.1%（14/1251例）。

　　据我们所知，这是首次报道肺癌病例中同时存在ALK，RET，ROS1或MET重排或扩增。如表1所示有多种组合，如ALK合并ROS1重排（4例，病例5-8）或RET重排（1例，病例4）；RET重排合并ROS 1重排（2例，病例13和14）；MET扩增合并ALK（3例，病例1~3），RET（4例，病例9~12）或ROS 1重排（1例，病例15）。四种基因的受累频率相似：ALK和MET均为53%（8/15例），RET和ROS 1均为47%（7/15例）。有趣的是，2例（病例9和10）检出以前未报道过的异常RET FISH信号模式。在病例9中，检出0R3～20G1～3F的信号模式，表明5'RET缺失和3'RET复制/扩增并存。Lee等人报道了一例RET重排阳性病例，其主要信号模式为1R2G1F，表明3’RET获得了额外拷贝，但无3’RET扩增。在病例10中，主要的信号模式是1R1G3~6F，表明RET重排合并完整RET基因拷贝数增加。虽然RET扩增在肺癌中的临床意义尚不明确，但先前的一项研究将其与EGFR突变并存联系起来。

　　过去认为酪氨酸激酶基因突变是相互排斥的独立事件，如EGFR、KRAS、HER 2、BRAF、ALK、RET、ROS 1和MET。然而，近年来已陆续报道肺癌中EGFR和ALK或其他基因改变并存的情况。例如20余例肺癌中EGFR和ALK或EGFR和ROS 1改变并存。Jurmeister等人报告了3例ALK重排肺癌同时伴有MET蛋白过表达，但无MET基因扩增。几项研究表明，伴EGFR和ALK改变的肺癌患者具有独特的临床特征，在治疗中加入ALK抑制剂可以改善总体生存率。上述数据均表明肺癌患者中可存在两个（或以上）驱动基因突变，这些组合具有潜在的临床意义。ALK、RET、ROS 1和MET等两个（或以上）驱动基因突变并存的频率较低，原因可能为：①肺癌中ALK、RET、ROS 1重排和MET扩增的发生率较低；②肺癌临床治疗策略改变，使得这些基因的检测更为严格。鉴于后者影响，过去6年中，本中心所有的肺癌病例中只有不到25%的患者同时检测了所有4项指标。

　　在进行FISH检测之前，这些患者在3至79个月间（中位20个月）确诊肺癌，其中3例为早期肺腺癌，12例为晚期肺腺癌。因此，在早期肺腺癌中也可检出这4种标志物的双阳性。ALK重排（7/8例）和MET扩增（8/8例）多见于晚期肺腺癌，而ROS 1和RET重排则可见于早期和晚期肺腺癌（表2）。此外，二代测序发现6例（病例2、6、10、12、13和15）存在TP 53突变；5例（病例1、12-15）存在EGFR突变；3例（病例1、8、9）含KRAS突变；2例（病例6和14）含STK 11突变。对这类罕见病例的研究表明，肺腺癌中可以同时检测到酪氨酸激酶功能相关基因和抑癌基因的改变。 即使施行有效的靶向治疗后，上述基因异常仍可导致疾病复发。

　　所有患者均根据分期采用手术切除、放射治疗和药物相结合的方案。部分患者接受了特异性靶向治疗：5例使用EGFR抑制剂（病例1、12-15），3例使用ALK抑制剂（病例2、5和7），3例使用PD-1抑制剂（病例7、8和12），但其临床经过均表现为暂时性部分缓解伴局部复发或新发转移。一名患者（病例12）目前正在接受RET抑制剂临床试验。虽然新一代特异性酪氨酸激酶抑制剂不失为一种选择，但尚无患者接受ROS1或MET抑制剂治疗。至随访结束时，3位患者已死亡（病例1、9和15），12例患者仍存活并部分缓解。

　　总结

　　这是首次报告肺癌病例中同时存在ALK、RET、ROS1重排或ME扩增。本研究中的一些病例也同时存在EGFR、KRAS和/或TP53突变。正如世界卫生组织（WHO）2015年度肺癌分类所提议，全面的分子图谱对肺癌的检查非常重要，肺癌中多分子改变的发现可能对这些患者有潜在的临床意义。

表一 15例肺腺癌临床病理特征及ALK、RET、ROS1或MET共突变情况

Table 2 Demographic summary and comparison of mutations by clinical staging in 15 lung adenocarcinoma patients

绿绣芙蓉

此类问题提示在生物信息数据分析的时候，突变点的阳性给出要客观。不能用排他性理论对可疑阳性点进行阴性处理。