肺的基底细胞样鳞癌(basaloid squamous cell carcinoma，BSC)与发生于其他黏膜及内脏的基底细胞样癌一样，是一类组织形态类似于皮肤基底细胞癌，但具有高度侵袭性且预后很差的恶性上皮性肿瘤。其临床影像学的表现及细胞形态学特征都与肺小细胞癌(small cell carcinoma)极易混淆，但二者首选的临床治疗方式却完全不同，因此它们的鉴别及准确诊断就成了细胞病理学医师必须面临并解决的问题。
有关肺BSC与小细胞癌细胞形态学对比的文献并不多[[url=]1[/url],[url=]2[/url],[url=]3[/url],[url=]4[/url],[url=]5[/url],[url=]6[/url]]，而国内也仅有组织病理学的个案报道及临床特点的总结研究[[url=]7[/url],[url=]8[/url]]。我们旨在通过对有组织学对照的肺BSC的细针穿刺、支气管刷片及肺泡灌洗液样本中细胞形态学的观察，及与肺小细胞癌相应样本的细胞形态学对比，力求寻找一些在鉴别诊断中有价值的形态学特点，为二者的准确诊断提供细胞形态学参考，避免误诊。
资料和方法
1．资料：
收集北京医院及北京同仁医院病理科2009年1月至2015年12月有组织病理学证实的肺BSC的细胞学样本17例。包括经支气管镜纵隔或肺门淋巴结细针穿刺(transbronchial needle aspiration)5例、支气管刷片4例、肺泡灌洗液3例、颈部淋巴结细针穿刺3例、经CT引导下肺细针穿刺涂片1例及超声引导下肝脏细针穿刺1例。另选取有组织病理学证实的肺小细胞癌的细胞学样本17例，其中支气管刷片9例、经支气管镜纵隔或肺门淋巴结细针穿刺6例、颈部淋巴结细针穿刺2例。
2．常规细胞学涂片：
17例BSC中，3例肺泡灌洗液使用ThinPrep液基薄片技术(TCT)制片，4例支气管刷片同时制作了液基薄片及传统涂片，其余10例细针穿刺样本全部由手工制成传统涂片。17例小细胞癌全部由手工制成传统涂片，其中9例支气管刷片同时制作了液基薄片。所有涂片均经95%乙醇固定20 min后行HE染色。对涂片中细胞团及单个细胞的比例、细胞团的排列及形态、拉丝及挤压假象、细胞核大小、细胞质、细胞核形态、核染色质分布、核仁、单个角化细胞、坏死、凋亡小体及核分裂象等17个形态学表现进行观察和比较。
3．细胞核大小的测量：
利用日本Hamamatsu公司的NanoZoomer Digital Pathology 2.0HT将细胞涂片扫描成像，每张涂片任意选取保存完好的100个细胞测量其最大径，之后计算平均值。
4．免疫组织(细胞)化学染色：
8例小细胞癌及10例BSC的细针穿刺样本均制成了细胞学蜡块，常规采用4 μm厚的细胞块石蜡切片做免疫组织化学染色。BSC组中的其余3例肺泡灌洗液，4例支气管刷片分别采用TCT液基薄片进行了免疫细胞化学EnVision法染色。所有抗体均购自Dako公司，包括甲状腺转录因子(TTF)1、细胞角蛋白(CK)7、CK5、p63、p40、嗜铬粒素A(CgA)、突触素、CD56和PAX5。而由于受样本的细胞量所限，采用液基薄片进行免疫细胞化学染色的4例支气管刷片和3例肺泡灌洗液的BSC病例，仅选取了TTF1、CD56、p40和CK5四种抗体进行染色。
5．分子病理学检测：
10例BSC穿刺样本使用人类表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物医学科技股份有限公司)，试剂盒采用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)检测EGFR突变，其中包含外显子18(G719X)、外显子19(19种缺失突变)、外显子20(S768I，3种插入突变，T790M)、外显子21(L858R及L861Q)共29个位点。EGFR突变型为外显子18、19、20、21至少一项有突变，否则为野生型。
6．统计学分析：
采用SPSS 19.0的软件进行统计学分析，对率的比较采用Fisher检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．临床特点：
BSC组中患者年龄50～81岁，中位年龄为65.3岁；男女比11∶6，其中12例患者有明确吸烟史，17例影像学均提示为中央型占位性病变。小细胞癌组中患者年龄46～78岁，中位年龄为61.5岁；男女比14∶3，17例患者均有明确吸烟史，影像学均提示为中央型占位性病变。
2．涂片细胞学形态特点的观察([url=]表1[/url])：
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肺基底细胞样鳞癌(BSC)与小细胞癌常规染色的主要形态学特点表现情况(例)
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根据文献的记载[[url=]6[/url]]，我们设定以30个细胞为限，多于30个细胞即认定为细胞团片。我们通过对细胞团片及单个细胞的比例，细胞团边缘的栅栏状排列，细胞团内出现菊形团及腺样囊性结构、核铸型(即核与核之间的镶嵌排列)、核的大小、染色质分布及核仁、单个角化细胞、坏死、凋亡及核分裂象等17项指标的观察，发现虽然BSC与小细胞癌在细胞形态上有许多相似的表现，诸如肿瘤细胞小、常呈裸核状、核染色质增粗、制片过程中易出现挤压变形、易出现坏死及凋亡小体等，但经过仔细比较二者还是存在一些细微的差别。在BSC组15/17的病例涂片中大部分肿瘤细胞呈黏附紧密的细胞团([url=]图1[/url])，所占比例明显高于小细胞癌组(3/17)；而小细胞癌组中则有14/17的病例呈现单个散在或三五成群、排列松散的细胞簇([url=]图2[/url])。我们在9例BSC、2例小细胞癌的细胞学样本中，观察到与BSC组织学特点相对应的呈栅栏状排列的肿瘤细胞。神经内分泌肿瘤所特有的菊形团结构可见于3例BSC及6例小细胞癌，而细胞团内出现多灶空白区的所谓腺样囊性结构仅见于3例BSC([url=]图1[/url])。核铸型是小细胞癌最突出的细胞形态学特点之一，17例小细胞癌中可以明确观察到这一表现，但仅在1例BSC出现了类似的形态。小细胞癌的肿瘤细胞易因机械性挤压而变形，核碎裂染色质拉长呈细丝状，特别是在小的组织学活检样本和传统涂片中更常见。本组研究中，14/17的小细胞癌可以观察到这一现象，而仅有2例BSC的细针穿刺涂片内可见少量拉丝及挤压假象。比较细胞核大小时发现，BSC的细胞核相对于小细胞癌要略大一些。15例BSC中，细胞核平均最大径在9～11 μm之间；而13例小细胞癌其细胞核平均最大径在7～9 μm之间。尽管两组病例中大部分肿瘤细胞呈裸核状，我们还是在15例BSC的肿瘤细胞中观察到少量的嗜伊红胞质，比例高于小细胞癌组(7例)，且后者多呈嗜碱性，但没有统计学上的显著差别。作为一类神经内分泌肿瘤，15例小细胞癌的细胞核具有其特征性的核染色质分布，即呈胡椒盐样；但也有2例小细胞癌其癌细胞可见针尖大小的核仁；相比之下，BSC绝大部分(16例)病例中可见针尖大小核仁，而仅有1例呈现出类似小细胞癌的胡椒盐样核。BSC可以在形态上出现鳞状上皮的分化，我们在9例BSC中看到了少量单个角化的细胞，而小细胞癌组所有病例均未见角化细胞。两组病例中都可见部分肿瘤细胞呈梭形(BSC组12例；小细胞癌组7例；[url=]图3[/url]，[url=]图4[/url])。关于坏死、凋亡小体及核分裂象等提示肿瘤高度侵袭性及高核增殖指数的相应指标，两组病例相比差别并不显著，BSC组分别为9、13及7例，而小细胞癌组则分别为10、15及11例。全部34个病例中也仅有1例BSC在背景中可见少量基底膜样物质。
图1
肺基底细胞样鳞癌(BSC)，细胞排列成紧密黏附的细胞团，周围有散在单个肿瘤细胞，无明显挤压及拉丝现象，细胞团中央可见筛状空腔似腺样囊性结构(红色箭头) HE 中倍放大
图2
小细胞癌，细胞单个散在或呈松散排列的细胞簇，背景中可见粉染颗粒状坏死物，并可见凋亡小体(红色箭头)及拉丝现象(蓝色箭头) HE 中倍放大
图3
BSC，细胞核圆整，可见清晰的针尖大小核仁(红色箭头)，部分细胞呈梭形(蓝色箭头) HE 高倍放大
图4
小细胞癌，右下角可见坏死及凋亡小体，细胞呈裸核状，有铸型(红色箭头)，核染色质呈胡椒盐样(蓝色箭头)，部分细胞呈梭形(黑色箭头) HE 高倍放大
图5
BSC，细胞块免疫组织化学显示p40强阳性EnVision法 高倍放大
图6
BSC，细胞块免疫组织化学显示TTF1阴性 EnVision法 高倍放大
图7
小细胞癌，细胞块免疫组织化学显示突触素强阳性 EnVision法 高倍放大
图8
小细胞癌，细胞块免疫组织化学显示PAX5局灶强阳性 EnVision法 高倍放大
3．免疫组织(细胞)化学染色结果对比：
BSC病例组中，2例支气管刷片及1例肺泡灌洗液最初误诊为小细胞癌，因同时取样的组织活检免疫组织化学证实为BSC，随后将上述病例额外制备的液基薄片采用免疫细胞化学染色证实后，修正了细胞学诊断。我们选用了日常工作中常用的几种鳞癌标志物(CK5、p63及p40)、小细胞癌标志物(TTF1、CD56、突触素、CgA)以及CK7、CD56对两组样本进行免疫组织化学标记。3种鳞癌标志物在染色的BSC病例中皆呈阳性，17例BSC可见CK5呈弥漫胞质着色，p40呈现强的核表达([url=]图5[/url])；10例穿刺样本的细胞块切片中呈现p63核强阳性表达。而小细胞癌的常用标志物TTF1([url=]图6[/url])、CgA及突触素则全部为阴性，但有6例BSC可见CD56的胞质内弥漫或点彩状着色。BSC组中10例细针穿刺样本有3例有CK7的胞质内弥漫及点彩状着色，PAX5皆为阴性。小细胞癌组8例穿刺样本的免疫组织化学染色中，小细胞癌的常用标志物TTF1、CD56及突触素全部呈阳性([url=]图7[/url])，7例呈现CgA胞质内颗粒状着色。而鳞癌标志物CK5及p40则全部为阴性，仅有1例p63呈现部分核阳性表达。3例呈现CK7胞质内点彩状着色，另有1例呈现局灶PAX5胞核强阳性([url=]图8[/url])。上述染色结果与对应组织学样本的免疫组织化学染色结果基本一致。
4．EGFR突变位点检测结果：
10例BSC穿刺样本中未检测出EGFR基因外显子18、19、20、21突变，10例均为野生型。检测结果与组织学样本一致。
讨论
1992年，Brambilla等[[url=]9[/url]]从115例分化差的肺癌中挑选出38例基底细胞样(鳞)癌的病例，第一次对肺的这一少见的非小细胞癌的特殊亚型，从组织病理学、免疫组织化学、超微结构及其临床特点等方面做了详尽的报道。2004版WHO肺胸膜纵隔肿瘤的分类中，按照形态上是否具有鳞癌的分化，将其分别定义为鳞癌和大细胞癌的基底细胞样亚型。而2015年最新版的WHO分类中，二者合并统称为BSC[[url=]10[/url]]。BSC在形态上可以分为单纯基底细胞样和伴有鳞状分化两种形式，前者表现为单一的小细胞形态，此类与小细胞癌鉴别尤为困难。
随着影像学的发展，各种影像引导下的细针穿刺细胞学，逐渐取代过去的组织活检成为肺肿瘤诊断的一种可靠方法，其诊断的敏感性和特异性可以分别达到92%和96%[[url=]11[/url]]，并可为下一步临床治疗方案的制定作出指导。而肺癌诊断的第一步就是要区分小细胞癌与非小细胞癌。虽然WHO分类中已经对小细胞癌与BSC的组织学及细胞学作出了明确的描述，但是二者之间存在很多形态特征上的重叠，特别是在没有组织结构显示的细胞学样本中，囿于有限的样本数量，不能进行相应的免疫组织化学染色时，仅凭细胞学形态做出诊断是非常困难和极具挑战性的。我们观察总结了17例BSC及17例小细胞癌细胞学病例的17项细胞形态学指标，发现在BSC中，肿瘤细胞多排列呈黏附紧密的细胞团片，其分布明显多于周围单个散在的肿瘤细胞；而小细胞癌则以单个散在分布的肿瘤细胞为主，鲜有排列拥挤紧密的大细胞团片。这与其他学者报道的研究结果一致[[url=]5[/url],[url=]6[/url]]。同时，Marks等[[url=]5[/url]]研究还发现，腺样囊性结构和单细胞角化是BSC区别于小细胞癌的特征性表现。我们的观察显示，BSC组中仅有3例出现腺样囊性结构，与小细胞癌组相比没有差异。BSC组有9例可以看到单细胞角化，而小细胞癌组中无一例出现单细胞角化，两组比较差异具有统计学意义。但是小细胞癌复合鳞癌(复合性小细胞癌)时，穿刺细胞学样本中也会看到鳞癌的分化，此时若以单细胞角化作为唯一的鉴别要点，就容易引起误诊，因此笔者认为单细胞角化不能作为BSC区别于小细胞癌的特征性表现。Dugan[[url=]6[/url]]提及在BSC中可见梭形细胞，而小细胞癌细胞却没有此类形态。我们的观察发现两组病例都可以查见梭形细胞，虽然BSC中更多见一些，但与小细胞癌相比差异无统计学意义。细胞呈栅栏状排列是BSC细胞巢周边的形态，9/17的BSC涂片中可以看到，而仅有2例的小细胞癌出现类似的结构，但二者相比同样差异无统计学意义。另外，BSC的肿瘤细胞多较小细胞癌略大一些(胞核最大径9～11 μm)，且大部分带有少量嗜酸性胞质，有特征性的针尖大小的小核仁；而小细胞癌则细胞更小一些(胞核最大径7～9 μm)，大部分呈裸核状，偶见少量嗜碱性胞质，核染色质呈现神经内分泌肿瘤所特有的胡椒盐样。核铸型及拉丝现象在小细胞癌中更常见。菊形团在鉴别两者时没有意义。由于二者同属于高度侵袭性，且具有高增殖活性的肿瘤，所以坏死、凋亡小体及核分裂象虽然两组比较时略有差异，但都不具有统计学意义。基底膜样物质是另一个被一些学者特别重视的形态学表现，我们的观察中也仅在1例BSC看到少量分布。总结上述细胞形态学特征，当肿瘤细胞多黏附成团、细胞核较小细胞癌略增大，没有明显拉丝现象及显著的镶嵌式排列(细胞铸型)，细胞核具有针尖大小的小核仁时，要特别注意观察细胞团片周围是否呈栅栏状排列、有无腺样囊性结构、单细胞角化及基底膜样物质，要想到BSC这一少见的非小细胞类型，以便利用辅助技术明确诊断。
显然，免疫组织化学的开展，不同抗体的应用，为我们鉴别这类形态相近的肿瘤提供了很好的工具。Maleki[[url=]4[/url]]推荐使用一组抗体p63或CK5/6，神经内分泌标记(CgA、突触素和CD56)及TTF1用以鉴别BSC和小细胞癌。我们选取了常用的一组鳞癌标志物(CK5、p63和p40)及小细胞癌标志物(TTF1、CgA、突触素和CD56)，以及文献中推荐的CK7和PAX5，对我们两组25个病例进行了免疫组织/细胞化学标记。染色结果显示，CK7对于二者没有鉴别意义，3/10的BSC和3/8的小细胞癌都可以有CK7胞质弥漫或点彩状着色。作为鳞癌的一个特殊亚型，三种常用的鳞癌标志物(CK5、p63和p40)在所有染色的BSC病例中皆呈阳性。但相对于CK5和p40而言，p63的特异性略低。我们的数据显示，1/8的小细胞癌呈现p63阳性，而全部小细胞癌表现为CK5及p40阴性。Au等[[url=]12[/url]]研究也显示，79.6%的小细胞癌和50.0%的大细胞神经内分泌癌可以表达p63。TTF1在鉴别上确有帮助，8例小细胞癌皆为阳性，而17例BSC为阴性，这与文献报道是一致的[[url=]3[/url]]，但值得注意的是约有5%～10%的小细胞癌不表达TTF1[[url=]10[/url]]。作为高级别的神经内分泌肿瘤，小细胞癌特征性地表达神经内分泌标志物CgA、突触素和CD56。从我们的数据看后两者的敏感性高于CgA，且6例BSC显示有CD56的表达，说明CD56的特异性较CgA和突触素略逊一筹。有文献提示PAX5可以表达于高级别神经内分泌癌，它在小细胞癌中可呈现强的核表达[[url=]13[/url]]。既然PAX5倾向于在小细胞癌中表达而在BSC中为阴性，那么PAX5可否作为又一个有用的鉴别抗体呢？鉴于我们的病例数有限，仅在1例小细胞癌中观察到了PAX5的局灶表达，还有待积累更多的病例证实。细胞学的标本量少，能够进行免疫组织化学染色的抗体数量受限，要想作出准确诊断必须经过精心选择。通过以上的研究分析，我们建议至少选用2种鳞癌标志物(CK5、p63或p40)和2种神经内分泌标志物(CgA、突触素或CD56)，配合TTF1共5个抗体作为BSC与小细胞癌鉴别诊断的一线抗体。
非小细胞肺癌患者治疗前应常规行EGFR基因突变检测已成为共识。最新美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)建议对肺鳞癌尤其是不吸烟、小活检组织或混合型鳞癌应考虑进行EGFR基因突变检测[[url=]14[/url]]。虽然该组研究中10例BSC并未检测出EGFR基因的突变，但在北京医院病理科外检的鳞癌标本中确实发现存在EGFR突变的病例。最近的一项Meta分析显示[[url=]15[/url]]，334例西欧肺鳞癌患者中EGFR基因突变率为3.3%，474例东亚肺鳞癌患者中EGFR基因突变率为4.6%。国内张卉等[[url=]16[/url]]在139例肺鳞癌中检测到25例EGFR基因突变，突变率为18%，明显高于国外多数文献报道的肺鳞癌EGFR基因突变率低于3.6%的研究结果。由此可以看出至少亚裔人群中，EGFR基因突变在肺鳞癌患者中也有发生。因此具有应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的可能。
综上所述，当细胞病理学医师在考虑小细胞癌的诊断，但又踌躇其不典型的形态特征时，要仔细观察肿瘤细胞的细微表现，有效利用免疫组织化学抗体组合，在相对常见的小细胞癌中鉴别出少见的BSC，为临床医师制定合理有效的治疗方案提供正确的依据。
发表于 2016-7-17 22:21:06
